【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：偽狂-犬病毒通用型(PRV-gB)熒光PCR檢測試劑盒

Name ：Pseudorabies Virus gB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

偽狂-犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰-疹病毒Ⅰ型、傳-染性延髓麻-痹病毒、奇癢癥病毒、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥-狀的皰-疹病毒[1]。豬是偽狂-犬病的*自然宿主，對其危害大?？芍氯?娠母豬流-產(chǎn)，產(chǎn)死-胎及胎兒干尸化。對初生仔豬則引起神經(jīng)癥-狀，出現(xiàn)運-動失-調(diào)，麻-痹，衰竭死亡，病死率 。成年豬多呈隱性感染，但可引起呼-吸道癥-狀[2]。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源，病毒主要從病豬的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除，有的帶毒豬可持續(xù)排-毒一年。

本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理，檢測偽狂-犬病毒，對偽狂-犬病毒引起的疾病及其并--發(fā)癥的診斷及療-效評估有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對偽狂-犬病毒gB基因高度保守區(qū)基因序列設計特異性引物和熒光探針[3]。在反應體系中含偽狂-犬病毒gB基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放 熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。

【試劑組成】

名 稱	規(guī) 格
核酸提取液	1.5mL×2 管
酶液	50μL×1 管
PRV-gB 反應液	1.0mL×1 管
PRV-gB 陽性質(zhì)控品	50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品	250μL ×1 管

偽狂-犬病毒通用型(PRV-gB)熒光PCR檢測試劑盒【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個丌同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取

0. 5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；分泌物棉拭子直接取 100μL 提??；血液取血清 100μL 提取。

1.2 DNA 提取

1) 對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000

rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒

（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣本總數(shù)每滿 7 份，則多配制 1 頭份 PCR 反應液)，單個測試反應液體系配制如下表：

試劑	PRV-gB 反應液	酶液
用量（樣本數(shù)為 N）	20μL	1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟	循環(huán)數(shù)	溫度	時間	收集熒光信號
1	1 cycle	95℃	10min	否
2	40 cycles	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、

stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，丏明顯的擴增曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，丏出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結(jié)果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線則為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。

6. 質(zhì)控標準

陰性對照：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性對照：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)丌超過 5 次，有效期 12 個月。

偽狂-犬病毒通用型(PRV-gB)熒光PCR檢測試劑盒【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺的豬，取腦、淋巴結(jié)、*、肺臟等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等，置于 50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血 5mL。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但丌能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【參考文獻】

[1] 婁高明，杜偉賢．偽狂-犬病流行概況及豬場防制策略[Ｊ]．中國動物檢疫，1999， 16（5）：43－45.

[2] 殷震，劉景華．動物病毒學[Ｍ]．北京：科學出版社，1997.

[3] 朱淑芬,朱瑞良,喬彩霞.檢測偽狂-犬病毒ｇＢ基因熒光定量ＰＣＲ方法的建立[J].中國獸醫(yī)學報，2012，32（10）:1413-1417.

產(chǎn)品圖片：

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱：上海烜雅生物科技有限公司

生產(chǎn)地址：金海公路3265號14幢11546室

上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的偽狂-犬病毒通用型(PRV-gB)熒光PCR檢測試劑盒質(zhì)量高，價格低，售后有保證。為您的實驗保駕護航。

本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷。

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