產(chǎn)品及特點(diǎn):

大片吸蟲探針法熒光定量PCR試劑盒是從土壤農(nóng)桿菌 CP4 菌株中分離得到的抗除草劑草甘膦基因，是轉(zhuǎn)基因植物研究中最為常用的一種篩選標(biāo)記基因，因此本公司根據(jù)探針法 qPCR 原理開發(fā)了專門用于檢測大片吸蟲探針法熒光定量PCR試劑盒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 根據(jù)大片吸蟲探針法熒光定量PCR試劑盒保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的大片吸蟲探針法熒光定量PCR試劑盒成分，但不能檢測其他非大片吸蟲探針法熒光定量PCR試劑盒成分。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整個(gè)檢測過程（按一個(gè)樣品計(jì)）所需時(shí)間僅為 2.0 小時(shí)。

6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR。

PCR在分子和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。

3結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

PCR實(shí)驗(yàn)步驟

典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：

將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；

人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長短；

耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。

通用原則：

1， 先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近于探針。

2， 擴(kuò)增子的長度應(yīng)不超過400bp，理想的*能在100－150bp內(nèi)，擴(kuò)增片斷約短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片斷也容易保證分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，及在SG分析中非特異信號。

4， 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）

5， 將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。

b），探針設(shè)計(jì)指導(dǎo)

1，在設(shè)計(jì)引物之前設(shè)計(jì)探針

2，探針的Tm值應(yīng)在68－70℃之間，如果是目測探針，則要仔細(xì)審查GC富含區(qū)。

3，探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會有淬滅作用，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在

4，選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針。

6， 探針應(yīng)盡可能的短，不要超過30個(gè)bp。

7， 檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)。

熒光化學(xué)物質(zhì)：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的*技術(shù)平臺。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。

3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

人腎素受體(Renin receptor)Polyclonal Antibody英文名稱： 1-Allylhydantoin CAS：3366-93-6 分子式：C6H8N2O2 分子量：140.14

人伯胺氧化酶膜(Membrane primary amine oxidase)Polyclonal Antibody英文名稱： Aminoacetonitrile bisulfate CAS：151-63-3 分子式：C2H4N2.H2SO4 分子量：154.14

人多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)Polyclonal Antibody英文名稱： 2-Aminoazotoluene Hydrochloride CAS：2298-13-7 分子式：C14H15N3.HCl 分子量：261.75

人糖蛋白α1B(A1BG)Polyclonal Antibody英文名稱： Allyl 2,2,2-Trichloroacetimidate CAS：51479-73-3 分子式：C5H6Cl3NO 分子量：202.46

人調(diào)亡誘導(dǎo)因子 1(AIFM1)Polyclonal Antibody英文名稱： Amidol CAS：137-09-7 分子式：C6H8N2O.2HCl 分子量：197.06

人無孢蛋白(ASPN)Polyclonal Antibody英文名稱： O-Allylhydroxylamine Hydrochloride CAS：38945-21-0 分子式：C3H7NO.HCl 分子量：109.55

人血清白蛋白(ALB)Polyclonal Antibody英文名稱： 1-Acetyl-2-imidazolidinone CAS：5391-39-9 分子式：C5H8N2O2 分子量：128.13

人α-2巨球蛋白(Alpha-2-M)Polyclonal Antibody英文名稱： 3-Acetylindole CAS：703-80-0 分子式：C10H9NO 分子量：159.19

*酚 中文別名：   莰菲醇，山柰酚-3，山柰素，山柰黃酮醇，四羥基黃酮， 百蕊草素Ⅲ 英文名：   Kaempferol CAS登錄號：   520-18-3 分子式：   C15H10O6 分子量：   286.24 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   黃色粉末 規(guī)格：   20mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實(shí)驗(yàn)等。 提取來源：   姜科植物山柰 Kaempferia galanga L.根莖 溶解性：   微溶于水，溶于熱乙醇，*和堿。 熔點(diǎn)：   276~278℃ ：   抗菌，對黃色葡萄球菌及綠膿桿菌、傷寒桿菌、均有。，。抑酶，抑制眼醛糖還原酶，有利于的。具有誘變劑活性，當(dāng)濃度為1×10-4mol/L時(shí)，可抑制淋巴細(xì)胞增殖。主要用于、抑制生育、抗、、抗氧化劑、、、利膽劑、。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

去甲氧基姜黃素 中文別名：   脫甲氧姜黃 英文名：   Demethoxycurcumin 英文別名：   Curcumin II CAS登錄號：   24939-17-1 分子式：   C20H18O5 分子量：   338.35 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   黃色粉末 規(guī)格：   20mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實(shí)驗(yàn)等。 提取來源：   姜科植物姜黃Curcuma longa L.的根莖。 ：   主要用于驅(qū)鉤蟲、、蟯蟲及混合感染。川楝素是苦楝皮的驅(qū)蛔有效成分，它比乙醇提取物的作用強(qiáng)，與山道年相比，作用緩慢而久。川楝素。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

秋水仙堿 中文別名：   秋水仙素 英文名：   Colchicine 英文別名：   Acetamide CAS登錄號：   64-86-8 分子式：   C22H25NO6 分子量：   399.44 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   蒼黃色鱗狀結(jié)晶或粉末 規(guī)格：   20mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測定/鑒定/藥理實(shí)驗(yàn)等。 提取來源：   百合科植物秋冊仙（Colchicum autumnale L.）的球莖和葉子，麗江慈菇（Iphigenia indica Kunth et Benth）等。 溶解性：   易溶于乙醇、氯仿，溶于水、*、苯，不溶于石油醚。 熔點(diǎn)：   150~160℃ 旋光度：   -250° (c=1, alcohol) ：   是抗及，用于急性及的。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年 

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