熒光定量PCR服務：

簡介：實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。

1、熒光定量PCR服務要求：

（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。

（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。

（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等

2、熒光定量PCR操作程序

（01）引物（探針）設計與合成。

（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉錄成cDNA。

（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結果分析。

（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結果）及引物等實驗材料。

3、熒光定量PCR的收費標準：

  我公司根據客戶的樣品數量進行不同的收費標準。

通用原則：

1， 先選擇好探針，然后設計引物使其盡可能的靠近于探針。

2， 擴增子的長度應不超過400bp，理想的*能在100－150bp內，擴增片斷約短，有效的擴增反應就越容易獲得。較短的擴增片斷也容易保證分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產生非特異反應，從而會導致擴增效率的降低，及在SG分析中非特異信號。

4， 為了保證效率和重復性，應避免重復的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）

5， 將引物和探針互相進行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結構的形成。

b），探針設計指導

1，在設計引物之前設計探針

2，探針的Tm值應在68－70℃之間，如果是目測探針，則要仔細審查GC富含區(qū)。

3，探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會有淬滅作用，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在

4，選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會降低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針。

6， 探針應盡可能的短，不要超過30個bp。

7， 檢測探針的DNA折疊和二級結構。

產品及特點:

隱襲腐霉探針法熒光定量PCR試劑盒是從土壤農桿菌 CP4 菌株中分離得到的抗除草劑草甘膦基因，是轉基因植物研究中最為常用的一種篩選標記基因，因此本公司根據探針法 qPCR 原理開發(fā)了專門用于檢測隱襲腐霉探針法熒光定量PCR試劑盒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 根據隱襲腐霉探針法熒光定量PCR試劑盒保守區(qū)域設計引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的隱襲腐霉探針法熒光定量PCR試劑盒成分，但不能檢測其他非隱襲腐霉探針法熒光定量PCR試劑盒成分。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。

6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR。

PCR在分子和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟：

方法

1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。

3結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

PCR實驗步驟

典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：

將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；

人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合，兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短；

耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。

熒光化學物質：

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F將其原理簡述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的*技術平臺。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。

3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光 。

PDTC （NF-κB抑制劑/抗氧化劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

Phorbol 12-myristate 13-acetate(PKC激活劑) Growth Factor For Cell Culture1mL

Pifithrin-a（p53抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

PMA/TPA （PKC激活劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

Pyrrolidinedithioca rbamin acid.  ammonium salt（NF-kB抑制劑/抗氧化劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

Rapamycin（FRAP/mTOR抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

SB203580（p38 MAPK抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

Simvastatin（HMG-CoA Reductase抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

S-Methyl-ITU . sulfate（iN0S抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

SMT（iNOS抑制劑）Growth Factor For Cell Culture1mL

SNP（NO供體）GS190 Yeast Strain1mL

SOD（抗氧化酶）GS200 Yeast Strain1mL

Sodium Butyrate （HDAC抑制劑）GST  Immobilization Kit1mL

Sodium orthovanadate （磷酸酯酶抑制劑）GST(Glutathione S-Transferase)1mL

SP600125 （JNK抑制劑）GT1-11mL

鹽酸海拉明-d6 質量規(guī)格：>98.5%,BR,可用于細胞培養(yǎng) Sparfloxacin

鹽酸海拉明(標準品) 質量規(guī)格：HPLC>98%,標準品 Sparfloxacin

"TPYAgarMedium

嗜鹽菌選擇性瓊脂 Halophilic Bacteria Selective Agar 用于副溶血性弧菌的選擇性分離培養(yǎng)(GB標準)

大豆卵磷脂 SPC 250克 BR，PC=26%

甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(MYP)250g/瓶用于蠟樣芽胞桿菌的計數、分離，每培養(yǎng)基中添加和incubationmedia甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(MYP)250g/瓶用于蠟樣芽胞桿菌的計數、分離，每培養(yǎng)基中添加和1201

大腸菌群培養(yǎng)基(日本) 250g 用于大腸菌群的固體平板檢測

IL13RA2 Others Mouse 小鼠 IL13RA2 / CD213A2 人細胞裂解液 (陽性對照) 

卵巢上皮細胞Many types of cells包裝：5 × 105次方(1ml)

CNDP2 Others Human 人 CNDP2 / CPGL / PEPA 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 

AAV-293細胞，胚腎細胞 人細胞,HCC-9724細胞 CL-0168Neuro-2a/N2a(小鼠腦神經瘤細胞)5×106cells/瓶×2

中國倉鼠卵巢細胞;CTLA4 Ig-24

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞;MC3T3-E1

 Valosin Peptide (VQY),porcine 99510-37-9 質量規(guī)格：>95%,BR

 Vasoactive Intestinal peptide 40077-57-4 質量規(guī)格：>95%,BR

 Z-Ala-Ala-Leu-pNA 61043-33-2 質量規(guī)格：>95%,BR

 TMC 202044 質量規(guī)格：純 度≥99%

 Manganese (II) carbonate 598-62-9 質量規(guī)格：>98%,BR

 Manganese (II) phosphate monobasic tetrahydrate 18718-07-5 質量規(guī)格：>98%,BR

 Melezitose monohydrate 10030-67-8 質量規(guī)格：>99%,BC

 Mepiquat chloride 24307-26-4 質量規(guī)格：>97%,植物激素級

 Metaphosphoric acid 37267-86-0 質量規(guī)格：>38%(HPO3),BR

 Methyl cinnamate 103-26-4 質量規(guī)格：>98%,BR

 Methyl dihydrojasmonate 24851-98-7 質量規(guī)格：>90%,植物激素級

 Methyl indole-4-carboxylate 39830-66-5 質量規(guī)格：>98%，BR

 Methylene green zinc chloride double salt 6722-15-2 質量規(guī)格：~65%,BS

 Methylene violet 3RAX 4569-86-2 質量規(guī)格：>90%，BS

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