1）RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認(rèn)實驗方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，*通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析、基因表達差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計、RNA提取、cDNA合成、qPCR

樣本采集、存放及運輸：

1、樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（zui多凍融3次）；

3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。

使用方法：

大腸桿菌0157熒光PCR檢測試劑盒注：所有試劑使用前需完全解凍，混合均勻，6,000rpm離心數(shù)秒后使用。

1.樣本處理（樣本處理區(qū)）

待檢樣本的核酸提取可采用RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等，具體提取方法請參照相關(guān)說明書；陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品無需提取，可直接使用。

2. 擴增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）

取N個（N=陰性質(zhì)控品+待檢樣本+陽性質(zhì)控品）PCR反應(yīng)管，每管分別加入FMD RT-PCR反應(yīng)液19μl、RT-PCR酶1 μl (也可根據(jù)每頭份用量計算N+1份FMD RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶所需總量，兩者混勻離心后分裝20 μl至單個PCR反應(yīng)管)。

組分每頭份用量FMD  RT-PCR反應(yīng)液19 μlRT-PCR酶。

1 .將所有PCR反應(yīng)管于6,000rpm離心30s，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

2.加樣（樣本處理區(qū)）

3.在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品各5 μl，蓋緊管蓋，于6,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。

PCR反應(yīng)五要素：

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3’端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)*個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列zui有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子*很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

大腸桿菌0157熒光PCR檢測試劑盒

蕓香葉苷

大鼠補體片斷*(C*)

磷脂酶D

苯甲氧羰酰琥珀酰亞胺

人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP-6)

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶測試盒

大鼠內(nèi)皮素1(ET-1)

人遲現(xiàn)抗原4(VLA4) 

雞弓形蟲循環(huán)抗原(TCA)

葡萄糖脫氫酶（GCDH)測試盒

人血管緊張肽酶A(ATA) 

大鼠腎素(Renin) 

大鼠P物質(zhì)(SP)

D-鳥氨酸鹽酸鹽

DL-α-生育酚醋酸酯

DL-組氨酸

人軟骨寡聚蛋白(COMP)

人套膜蛋白(iNV)

NADP蘋果酸酶（NADP-ME）測試盒

水樣中六價鉻離子（Cr6+）濃度測試盒

5-尿苷一磷酸

幾丁質(zhì)酶測試盒

人雌二醇(E2)

人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)

DL-高半胱氨酸硫酸內(nèi)酯鹽酸鹽

對二甲氨基亞芐基羅丹寧

N-硝基-L-精氨酸

人集蛋白亞家族成員11(COLEC11)

BOC-L-苯丙氨酸

CBZ-L-亮氨酸

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ/細胞色素C氧化酶測試盒

人抗巨細胞抗體IgM(anti-CMV IgM) 

人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)

植酸酶

9,10-二丁氧基蒽

干酪素鈉

土壤全磷含量測定

山羊促生長釋放(GHRH)

人胸腺五肽(TP-5)

人基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/Gelatinase B)

維生素E油

α-酮基異己酸鈉鹽

木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）測試盒

大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細胞膠原酶(MMP-8)

黃苷-5'-單磷酸鈉

人骨形成蛋白6(BMP-6)

兔Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX) 

人α2巨球蛋白(α2-MG)

大鼠抗IVIgG抗體

7β,10β-二甲氧基多西紫杉醇

人青少年2型血色素沉著癥/幼年型血色病相關(guān)蛋白2(HFE2)