PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

4-氯水楊酸 5106-98-9谷轉(zhuǎn)氨酶2(ALT2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)≥98.0%(GC)

4-氯水楊酸 5106-98-94-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(ABAT)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)≥98.0%(GC)

4-氯水楊酸 5106-98-9鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)≥98.0%(GC)

1-Boc-L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸 51077-14-6磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶1(PSAT1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

Boc-Lys(Z)-pNA 51078-31-0酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

Boc-Lys(Z)-pNA 51078-31-0松弛肽2(RLN2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

5-甲氧基-1-茚酮 5111-70-6松弛肽3(RLN3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

5-甲氧基-1-茚酮 5111-70-6二肽基肽酶3(DPP3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

5-甲氧基-1-茚酮 5111-70-6二肽基肽酶7(DPP7)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

4-芐基-4-羥基哌啶 51135-96-7二肽基肽酶8(DPP8)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)97%

4-芐基-4-羥基哌啶 51135-96-7胞漿-5',3'-核苷酸酶(NT5C)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)97%

(R)-(-)-Ibuprofen 51146-57-7線粒體-5'-核苷酸酶(NT5M)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)97%

3,6-二氯噠-4-甲酸 51149-08-73',5'-二磷酸核苷酸酶1(BPNT1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

3,6-二氯噠-4-甲酸 51149-08-7受體2(TR2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

八甘 5117-19-1受體4(TR4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%
博茲曼熒光桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒頭孢妥侖匹酯  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢替坦  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：≥98%,甘草提取

頭孢替安鹽酸鹽  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢替安鹽酸鹽  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢他啶五水化合物  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢他啶-d5  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢他啶(含碳酸鈉)  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢噻肟鈉,噻孢霉素,頭孢霉素,先鋒霉素I  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢噻肟鈉  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢噻呋鈉  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：>98%,選擇性組蛋白脫乙酰酶(HDAC6)抑制劑

頭孢噻呋鈉  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：GC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

頭孢噻呋  現(xiàn)貨供應(yīng)   ：≥98%，BR

亞碲酸鈉肉湯培養(yǎng)礎(chǔ)英文名稱：Methazolamide：100mg保存：-20℃，避光

產(chǎn)毒培養(yǎng)英文名稱：Pi do Maude：100mg保存：-20℃，避光

葡萄球菌增菌肉湯英文名稱：The double sulfur compounds：100mg保存：-20℃，避光

貝爾德-帕克瓊脂英文名稱：Nicardipine hydrochloride：50mg保存：-20℃，避光

CHAPMAN瓊脂英文名稱：Nitrendipine：100mg保存：-20℃，避光

卵黃甘露高鹽瓊脂礎(chǔ)英文名稱：Oxaliplatin：100mg保存：-20℃，避光

改良Giolitti-Cantobi肉湯英文名稱：Moclobemide：100mg保存：-20℃，避光

甘露鹽瓊脂英文名稱：Hydroxychloroquine sulfate：50mg保存：-20℃，避光

牛奶培養(yǎng)基Herba ephedrae麻黃探針法PCR鑒定試劑盒   250g

乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基Radix ephedrae麻黃根探針法PCR鑒定試劑盒  LBS Agar250g

MRS培養(yǎng)基Semen strychni馬錢子探針法PCR鑒定試劑盒     MRS Medium250g

微生物學(xué)接種體肉湯Radix ophiopogonis麥冬探針法PCR鑒定試劑盒     Micro Inoculum Broth250g

雙岐桿菌生化用基礎(chǔ)培養(yǎng)基Fructus hordei germinatus麥芽探針法PCR鑒定試劑盒     The Biochemical Basis of Bifidobacterium Medium250g

Herba ephedrae麻黃探針法PCR鑒定試劑盒   10×100μg現(xiàn)貨DMSO?20°C干燥避光保存12個月紅色粉末，用于檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

Radix ephedrae麻黃根探針法PCR鑒定試劑盒  20 μL現(xiàn)貨DMSO?20°C干燥避光保存12個月紅色粉末，用于檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

Semen strychni馬錢子探針法PCR鑒定試劑盒     1 mg現(xiàn)貨DMSO?20°C干燥避光保存12個月用于檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

Radix ophiopogonis麥冬探針法PCR鑒定試劑盒     1 mg現(xiàn)貨DMSO?20°C干燥避光保存12個月用于檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

Fructus hordei germinatus麥芽探針法PCR鑒定試劑盒     1 mg現(xiàn)貨DMSO?20°C干燥避光保存12個月用于檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度
實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。