熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

白介素9(IL-9)ELISA試劑盒Prostatic Acid Phosphatase (D3Y5P) Rabbit mAb100 ul

白介素8(IL-8/CXCL8)ELISA試劑盒uPAR (D4Q5S) Rabbit mAb500 ul

白介素6(IL-6)ELISA試劑盒 SimpleChIP? Human StAR Intron 1 Primers1 Kit

白介素5(IL-5)ELISA試劑盒Glycolysis II Antibody Sampler Kit100 ul

白介素4(IL-4)ELISA試劑盒LGP2 (D3I3L) Rabbit mAb500 ul

白介素32(IL-32)ELISA試劑盒SimpleChIP? Mouse MEST Intron 1 Primers1 Pack

白介素3(IL-3)ELISA試劑盒SignalSlide? NF-κB p65 IHC Controls300 ul

白介素27(IL-27)ELISA試劑盒SignalSilence? Sharpin siRNA I300 units
碩大利什曼原蟲探針法熒光定量PCR試劑盒腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因抗體0.156-10ng/mlKLK5|Kallikrein-like protein 2(KLK-L2)|Stratum corneum tryptic enzyme

腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子/上皮鋅指蛋白抗體0.156-10ng/mlLN|Laminin|LAM

血藍(lán)蛋白抗體31.2-2000pg/mlLeptin|LEP|LEPD|OBS|Obesity Homolog

kappa型阿片受體抗體15.625-1000pg/mlLeptin R|Leptin receptor|CD295|LEP-R|LR|LEPRD|OB-R|OBR

原癌基因K-ras抗體0.313-20ng/mlLIFR|LIFR|CD118|LIF R beta|LIFR|CD118|CD118 antigen|leukemia inhibitory factor receptor|leukemia inhibitory factor receptor alpha|LIF receptor|LIF-R|SJS2|STWS|SWS

層粘蛋白α5抗體0.313-20ng/mlLumican|LUM|LDC|SLRR2D

抗L-瓜氨酸抗體15.625-1000pg/mlMCP-1|CCL2|GDCF-2|HC11|HSMCR30|MCAF|MCP1|SCYA2|SMC-CF

低密度脂蛋白受體抗體62.5-4000pg/mlMDC|CCL22|ABCD-1|MDC|STCP-1|A-152E5.1|ABCD-1|CC chemokine STCP-1|C-C motif chemokine 22|chemokine(C-C motif) ligand 22|DC|B-CK|Macrophage-derived chemokine|MDCStimulated T-cell chemotactic protein 1|MGC34554|SCYA22MDC(1-69)|small inducible cytokine A22|small inducible cytokine subfamily A(Cys-Cys)|member 22|Small-inducible cytokine A22|STCP-1|stimulated T cell chemotactic protein 1

瘦素抗體0.312-20ng/mlMer|MERTK

瘦素受體抗體62.5-4000pg/mlC-ERC|Mesothelin

腸上皮干細(xì)胞蛋白抗體31.2-2000pg/mlMFGE8|SED1|Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8)|MFGM|Breast epithelial antigen BA46|HMFG|

鼠抗人促黃體生成素抗體7.813-500pg/mlMIA1|MIA

L-組氨酸脫羧酶抗體 hu, mo, rat, bov, dog, pig, chi15.625-1000pg/mlMK(Midkine)|MDK|ARAP|MEK|MK1|NEGF2|Amphiregulin-associated protein|Midgestation and kidney protein|midkine|midkine(neurite growth-promoting factor 2)|Neurite outgrowth-promoting factor 2|Neurite outgrowth-promoting protein

黃體激素釋放激素抗體/促性腺激素釋放激素抗體23.438-1500pg/mlMIP-1α(Macrophage Inflammatory Protein 1 Alpha)|CCL3|LD78ALPHA|MIP-1-alpha|MIP1A|SCYA3|G0S19-1

白血病抑制因子抗體15.625-1000pg/mlMIP-3α|MIP-3a|CCL20|CKb4|LARC|MIP3A|SCYA20|ST38

Dihydromyricetin周期素依賴性激酶5檢測(cè)試劑盒10mg

鹽育亨賓 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR Yohimbine HCl

甘氨受體β(GLRβ)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 NAP-2 / PPBP / CXCL7 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)250(g)

HO2(Human heme oxygenase 2) ELISA Kit  人血紅素氧合酶2CAS號(hào)：1177873一氧化氮檢測(cè)試盒100THuman/人Elisa試盒302962498

Myricetin主要組織相容性復(fù)合體，II類，DQα2檢測(cè)試劑盒20mg

 糖發(fā)酵管培養(yǎng)基/糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)基/糖復(fù)發(fā)酵管培養(yǎng)基/糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基/糖復(fù)發(fā)酵胨水/Lactose Ferment Broth用于大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的測(cè)定250克國產(chǎn)/進(jìn)口

組蛋白H3(H3)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 NKG2D / CD314 / KLRK1 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷250(g)

M2PK (Human Pyruvate Kinase) ELISA Kit  人激酶M2型同工酶CAS號(hào)：117772700胰蛋白酶抑制檢測(cè)試盒50THuman/人Elisa試盒3030066

98%100g5g直接膽紅素(DBIL)檢測(cè)試劑盒(改良JendrassikGrof微板法)Cyclindependent kinase 4

丁香 訂購|咨詢 規(guī)格： HPLC≥99%;20mg 化BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白抗體 sAC ELISA Kit 可溶性腺苷環(huán)化酶(sAC)ELISA試劑盒

Rabbit AntiHRP  兔抗HRP            （親和層析純化）進(jìn)口、分裝肺炎支原體IgM抗體檢測(cè)試盒10gHuman/人Elisa試盒475207591

98%5g25g總膽紅素(TBIL)檢測(cè)試劑盒(BOD比色法)Epidermal growth factor receptor antibody

蒲公英 訂購|咨詢 規(guī)格： 0.5g 人胱硫γ裂解酶 (Cystathionine gamma-lyase)ELISA試劑盒人96T0.78-50 ng/mL小鼠白介素33(IL-33)ELISA試劑盒，英文名：IL-33 ELISA Kit

AntiHAS(human serum albumin)  兔抗人血清白蛋白   （親和層析純化）進(jìn)口、原裝偽狂犬病檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒475207591

97%500g1g總膽紅素(TBIL)檢測(cè)試劑盒(BOD微板法)C1q And Tumor Necrosis Factor Related Protein 12

異葒草素 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 叉頭蛋白O4抗體 MAGT1 ELISA Kit 鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MAGT1)ELISA試劑盒

Rabbit Antihuman IgG  兔抗人IgG          （親和層析純化）現(xiàn)貨供應(yīng)脂酶C檢測(cè)試盒500gHuman/人Elisa試盒4752107