熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

實(shí)時熒光定量PCR：

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

豬內(nèi)皮素1(ET-1)ELISA試劑盒E4BP4/NFIL3 (D5K8O) Rabbit mAb100 ul

豬內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)ELISA試劑盒C-Reactive Protein (D1N1U) Rabbit mAb100 ul

豬內(nèi)皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA試劑盒NAE1/APPBP1 (D9I4Z) Rabbit mAb100 ul

豬二胺氧化酶(DAO)ELISA試劑盒Spi-B (D3C5E) Rabbit mAb100 ul

豬地塞米松(Dex)ELISA試劑盒NFAT1 (D43B1) XP? Rabbit mAb (Alexa Fluor? 488 Conjugate)100 ul

豬D二聚體(D2D)ELISA試劑盒TRIM5α (D6Z8L) Rabbit mAb100 ul

豬C反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA試劑盒GCKR (D1W9P) Rabbit mAb100 ul

豬皮質(zhì)醇(Cortisol)ELISA試劑盒Phospho-GSK-3β (Ser9) (D85E12) XP? Rabbit mAb (Alexa Fluor? 647 Conjugate)100 ul
分枝桿菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒帽柱葉堿0.156-10ng/mlSP1|Sp1 transcription factor|Transcription factor Sp1|TSFP1

天竺葵素-3-氯化葡萄糖苷0.156-10ng/mlADPSP|FSP2|KIAA1083|SPAST|Spastic paraplegia 4 protein|spastin|SPG4

氯化阿拉伯糖苷芍藥素78-5000pg/mlSCCA1(Squamous Cell Carcinoma Antigen 1)SERPINB3|T4-A|HsT1196|Protein T4-A|SCC|SCCA|SCCA-1|SCCA-PD|serpin B3|serpin peptidase inhibitor|clade B(ovalbumin)|member 3

氯化半乳糖苷芍藥素1.563-100ng/mlγGT1|GGT1((Gamma Glutamyltransferase 1))|GGT|Leukotriene-C4 hydrolase|Glutathione hydrolase 1|Gamma-glutamyltranspeptidase 1

氯化葡萄糖苷芍藥素0.625-40ng/mlCERK(Ceramide kinase)|hCERK|LK4|Acylsphingosine kinase|Lipid kinase 4

氯化芍藥素0.312-20ng/mlFCGRT|FCRN|IgG Fc fragment receptor transporter alpha chain|Neonatal Fc receptor|alpha-chain|Fc fragment of IgG|receptor|transporter|alpha|FcRn alpha chain|immunoglobulin receptor|intestinal|heavy chain|major histocompatibility complex class I-like Fc receptor|neonatal Fc-receptor for Ig

矮牽牛素阿拉伯糖苷0.156-10ng/mlSULF1

矮牽牛素半乳糖苷0.156-10ng/mlPRKCA(Protein kinase C alpha type)|PKCA|AAG6|PKC-A|PKC-alpha|PRKACA|aging-associated gene 6|protein kinase C|alpha

矮牽牛素葡萄糖苷0.156-10ng/mlTIGIT

氯化矮牽牛素0.156-10ng/mlELOVL1(Elongation of very long chain fatty acids protein 1)|CGI-88|SSC1|ELOVL FA elongase 1|Very-long-chain 3-oxoacyl-CoA synthase 1|3-keto acyl-CoA synthase ELOVL1|ELOVL fatty acid elongase 1

葉含翅果定堿0.625-40ng/mlRYR2(Ryanodine receptor 2)|RYR-2|RyR2|hRYR-2|Cardiac muscle ryanodine receptor|Cardiac muscle ryanodine receptor-calcium release channel|Type 2 ryanodine receptor

恩卡林堿C0.313-20ng/mlTight junction protein 1|Tight junction protein ZO 1|TJP1|ZO 1|ZO1|ZO-1|Zona occludens protein 1|Zonula occludens protein 1

繡線菊甙3.125-200ng/mlAnti-LAMP2

大豆甾醇A0.313-20ng/mlAdenosine deaminase|Adenosine aminohydrolase|ADA|ADA1

大豆甾醇B0.312-20ng/mlDBT|BCATE2|BCKAD-E2|BCKADE2|E2|E2B|Dihydrolipoyllysine-residue(2-methylpropanoyl)transferase|Dihydrolipoamide branched chain transacylase|Branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase complex component E2|Dihydrolipoamide acetyltransferase component of branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase complex

98%25g100ml槲皮素3O蕓香糖苷60800Kallikrein 10

7-羥基利培 質(zhì)量規(guī)格：國進(jìn)口 7-Hydroxy Risperidone 人結(jié)腸細(xì)胞英文名稱：HCT 116

5-氨基-3-羧基-2,4,6-三碘-N-基苯酰標(biāo)準(zhǔn)品

Tn I (Human Troponin I ) ELISA Kit  人肌鈣蛋白ⅠCAS號：605625 L(+)3羥脂酰輔酶A脫氫酶檢測試盒100gHuman/人Elisa試盒30674807

98%5g5g基 3O阿魏?？?7865Hormonesensitive lipase

人參皂苷Rb3;Ginseside 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 化肌球蛋白輕鏈9抗體  

SAA(Human Serum amyloid A) ELISA Kit  人血清淀粉樣蛋白ACAS號：463 NADP依賴蘋果脫氫酶檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒3068324

98%25g100g乳脫酶(LDH)檢測試劑盒(二硝基肼比色法)Membrane Protein, Palmitoylated 2

異辛醇(standard for GC, ≥99.5% (GC)) 質(zhì)量規(guī)格：standard for GC, ≥99.5% (GC) 2-Ethyl-1-hexanol

A Beta2940( BetaAmyloid 2940)  β淀粉樣肽2940(野生型)特價促銷CD28分子檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒488482

98%1g50g乳脫酶(LDH)檢測試劑盒(二硝基肼微板法)Membrane Protein, Palmitoylated

 細(xì)胞間粘附分子3(ICAM3)重組蛋白英文名稱：Recombinant Intercellular Adhesion Molecule 3 (ICAM3)

A Beta2942( BetaAmyloid 2942)  β淀粉樣肽2942(野生型)進(jìn)口、分裝CD25分子檢測試盒100gHuman/人Elisa試盒4885023

98%100g10g乳脫酶(LDH)檢測試劑盒(LDP比色法)S.agalactiae

異辛(Standard for GC,≥99.5%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：Standard for GC,≥99.5%(GC) 2-Ethylhexanoic acid

BetaAmyloid (142)  β淀粉樣肽（142）（多肽蛋白）進(jìn)口、原裝程序性死亡1檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒4885023