PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

小鼠腎素(Renin)ELISA試劑盒S6 Ribosomal Protein (54D2) Mouse mAb (HRP Conjugate)100 ul

小鼠正常T細胞表達和分泌因子(RANTES/CCL5)ELISA試劑盒 TPP1 (D4E2R) Rabbit mAb100 ul

小鼠還原型谷胱甘肽(GSH)ELISA試劑盒 HSD17B6 (D1T5H) Rabbit mAb100 ul

小鼠核因子κB受體活化因子配基(RANKL)ELISA試劑盒UCP1 (D9D6X) Rabbit mAb100 ul

小鼠Qa淋巴細胞抗原2(Qa-2)ELISA試劑盒 ANT2/SLC25A5 (E2B9D) Rabbit mAb100 ul

小鼠丙酮酸激酶(PK)ELISA試劑盒 IMP2 (D4R2F) Rabbit mAb100 ul

小鼠丙酮酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA試劑盒STAM2 Antibody100 ul

小鼠丙酮酸脫氫酶E1(PDH E1) ELISA試劑盒Sec24C (D9M4N) Rabbit mAb100 ul
豬鼻支原體探針法熒光定量PCR試劑盒五味子甲素15.6-1000pg/mlPYY2|Putative peptide YY-2|Putative peptide YY2

五味子乙素0.312-20ng/mlNDUFS8|NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8|mitochondrial|TYKY subunit|Complex I-23kD|CI-23kD|NADH-ubiquinone oxidoreductase 23 kDa subunit|TYKY|CI-23k|CI23KD

戈米辛G15.6-1000pg/mlDSCR6|Protein ripply3|Down syndrome critical region protein 6|RIPPLY3

吳茱萸內(nèi)酯0.312-20ng/mlCYP2C9|Cytochrome P450 2C9|Cytochrome P450 MP-4|Cytochrome P-450MP|CYPIIC9|(S)-limonene 7-monooxygenase|S-mephenytoin 4-hydroxylase|Cytochrome P450 PB-1|Cytochrome P450 MP-8|(R)-limonene 6-monooxygenase|(S)-limonene 6-monooxygenase|CYP2C10|CPC9|CYP2C

吳茱萸新堿0.78-50ng/mlGOT2|Aspartate aminotransferase|mitochondrial|mAspAT|Kynurenine--oxoglutarate transaminase IV|Kynurenine--oxoglutarate transaminase 4|Transaminase A|Plasma membrane-associated fatty acid-binding protein|FABPpm|Transaminase A|Plasma membrane-associated fatty acid-binding protein|FABPpm|Fatty acid-binding protein|FABP-1|Glutamate oxaloacetate transaminase 2|KAT4|KATIV|mitAAT

吳茱萸堿0.625-40ng/mlOSGIN2|Oxidative stress-induced growth inhibitor 2|hT41|C8orf1

去氫吳茱萸堿0.312-20ng/mlPCDH1|Protocadherin-1|Cadherin-like protein 1|Protocadherin-42|PC42|PCDH42|protocadherin 42|Protocadherin-42|cadherin-like 1

吳茱萸次堿0.78-50ng/mlDEXI|MYLE(Dexamethasone-induced protein)|Protein MYLE

烏藥醇 1.56-100ng/mlMEP1B(Meprin A subunit beta)|Endopeptidase-2|PABA peptide hydrolase|PPH beta|Meprin beta Subunit|meprin A|beta|Meprin B|N-benzoyl-L-tyrosyl-p-amino-benzoic acid hydrolase beta subunit|N-benzoyl-L-tyrosyl-P-amino-benzoic acid hydrolase subunit beta

王不留行黃酮苷78-5000pg/mlCTSA(Lysosomal protective protein)|GLB2|PPCA|GSL|NGBE|PPGB|Lysosomal Carboxypeptidase A|beta-galactosidase 2|beta-galactosidase protective protein|Carboxypeptidase C|Carboxypeptidase L|cathepsin A|protective protein for beta-galactosidase(galactosialidosis)|Protective protein cathepsin A|Protective protein for beta-galactosidase

 1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖0.781-50ng/mlSPB(Pulmonary Surfactant Associated Protein B)|SFTPB|SP-B|SFTP3|Pulmonary surfactant-associated proteolipid SPL(Phe)|18 kDa pulmonary-surfactant protein|6 kDa protein

98%10g100g基 4啡?？?03439507YKL40

貝母堿 訂購|咨詢 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg ELISA Kit for Arginine vasopressin小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR/CD71)ELISA試劑盒，英文名：TFR/CD71 ELISA Kit

Naringin阿莫沙平標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人載脂蛋白C3(Apo-C3)CLIA試劑盒 0.2ml

VCL(Human vinculin) ELISA Kit  人紐蛋白CAS號：514鎂原卟啉檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒30766224

97%100g5g25脫升麻醇 3ObetaD木糖苷methylmalonic acid

L-賴氨 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 L-Lysine 釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤

Naringenin阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人Apelin 36(AP36)CLIA試劑盒 0.2ml

Ntn4(Human Netrin4) ELISA Kit  人軸突生長誘向子4CAS號：489 原脫植基葉綠素檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒30766224

D蟲熒光素鹽 5mg

 糖化血紅蛋白A1c(HbA1c)天然蛋白 英文名稱：Native Glycated Hemoglobin A1c (HbA1c)

ADM 152/AM 152 (Adrenomedullin 152)  上腺髓質(zhì)素(152)進口、分裝Osterix蛋白檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒492273

D蟲熒光素鹽 5mg

9,10-二甲基蒽(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 9,10-Dimethylanthracene

ACTH (Adrenorticotrophin hormons)(1839)  促上腺皮質(zhì)激素（1839）(抗原)進口、原裝CXC趨化子配體13檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒492273

D蟲熒光素鹽 5mg

 基質(zhì)金屬蛋白酶12(MMP12)重組蛋白英文名稱：Recombinant Matrix Metalloproteinase 12 (MMP12)

Bile salt No. 5BR，70%連環(huán)蛋白β檢測試盒20mg白細胞介素1β檢測試盒Interleukin1receptorantagonist
實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。