定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

猴白介素2(IL-2)ELISA試劑盒Phospho-Histone H2A.X (Ser139) (D7T2V) Mouse mAb (Alexa Fluor? 488 Conjugate)100 ul

猴γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒Cleaved Lamin A (Asp230) Antibody100 ul

猴胰島素(INS)ELISA試劑盒 Lamin A/C Antibody20 ul

猴透明質(zhì)酸(HA)ELISA試劑盒 Lamin A/C Antibody100 ul

猴Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)ELISA試劑盒 DHCR24/Seladin-1 (C59D8) Rabbit mAb100 ul

猴B病毒(BV)ELISA試劑盒Cleaved Lamin A (Small Subunit) Antibody100 ul

猴載脂蛋白B100(apo-B100)ELISA試劑盒 Cleaved Lamin A (Small Subunit) (30H5) Mouse mAb100 ul

猴載脂蛋白A1(apo-A1)ELISA試劑盒 GFP (D5.1) XP? Rabbit mAb (HRP Conjugate)100 ul
奧斯特奧斯特線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒人雌激素（estrogen）0.156-10ng/mlCOL13|COLXIIIA1

人孕激素（Progesterone）0.156-10ng/mlCOL14|Undulin|UND

人促甲狀腺素(TSH)0.313-20ng/mlCOL15

人皮質(zhì)醇(Cortisol)ELISA Kit3.125-200ng/mlCOL17|180 kDa bullous pemphigoid antigen 2|Bullous pemphigoid antigen 2|BP180|BPAG2

人雌二醇(E2)0.156-10ng/mlCOL1α2|COL1A2|OI4

人三碘甲狀腺原氨酸(T3)ELISA Kit46.875-3000pg/mlCOL2(Collagen Type Ⅱ)|Chondrocalcin|COL2A1|SEDC|Alpha-1 type II collagen|ANFH|AOM|cartilage collagen|COL11A3|Collagen 2|collagen alpha-1(II) chain|collagen II|alpha-1 polypeptide|collagen type 2

人甲狀腺素(T4)0.625-40ng/mlCOL3|COL3A1|EDS4A|COL3A1|EDS4A|alpha1(III) collagen|Collagen 3|collagen alpha-1(III) chain|collagen|fetal|collagen|type III|alpha 1|Collagen-3|EDS4A|Ehlers-Danlos syndrome type IV|autosomal dominant

人游離甲狀腺素(Free-T4)0.781-50ng/mlCOL4|Type-IV Collagen

游離三碘甲狀腺原氨酸(Free-T3)7.813-500ng/mlCOL5α2|COL5A2|EDSC

人新生甲狀腺素(NN-T4)3.125-200ng/mlCOL6

人胰島素(Insulin)ELISA Kit0.156-10ng/mlCOL6α1|COL6A1|OPL

人C-肽(C-Peptide)31.25-2000pg/mlCOL6α3|COL6A3|DYT27

人促腎上腺激素皮質(zhì)激素(ATH)0.156-10ng/mlCOL8α1(Collagen Type VIII Alpha 1)

人絨毛促性腺激素(HCG)0.625-40ng/mlCPE|Carboxypeptidase H|Convertase

人絨毛促性腺激素β(β-HCG)31.25-2000pg/mlCPP|CT-proAVP|C-Terminal Provasopressin|Vasopressin-Neurophysin 2-Copeptin

98%25g500g楮樹黃醇F6980183Arginase

蘆丁/蕓香葉苷 質(zhì)量規(guī)格：>97%,BR Rutin

內(nèi)皮素1(EDN1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 EGFL6 / EGF-L6 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷250(g)

人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)子(EGF)SDHC  琥珀細(xì)胞色素亞基B560抗體規(guī)格:96T/48T規(guī)格:200mgS100鈣結(jié)合蛋白A9檢測(cè)試盒20mg人前列腺癌細(xì)胞，PC3細(xì)胞1x10^6cells

98%10g25g5,7二基黃41083118arginine vasopressin

湖貝甲素;YY90410梭砂貝母堿 規(guī)格： HPLC≥95%;20mg 訂購(gòu)|咨詢 ELISA Kit for Human NMDA receptor-regulated protein 2大鼠抗α-胞襯蛋白抗體IgG/IgA(α-Fodrin IgG/IgA)ELISA試劑盒，英文名：α-Fodrin IgG/IgA ELISA Kit

鈉素(BNP)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 CCL27 / CTACK 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)250(g)

人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)子(CNTF)Nucleolin/C23  核仁蛋白C23抗體規(guī)格:96T/48T規(guī)格:100mgSalusinα蛋白檢測(cè)試盒20mg人前列腺癌細(xì)胞，VCaP細(xì)胞1x10^6cells

磺基羅丹明G5mg

甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=6%) 質(zhì)量規(guī)格：10μg/ml,u=6% Metalaxyl solution

Peptone From Casein Agar生物制品無(wú)菌試驗(yàn)肝素檢測(cè)試盒20mg基質(zhì)金屬蛋白酶1檢測(cè)試盒Matrixmetalloproteinase13

磺基羅丹明B5mg

 卵黃高鹽瓊脂基礎(chǔ)/Egg-Yolk Salt Agar Base藥品、生物制品金黃色葡萄球菌選擇性分離250克國(guó)產(chǎn)/進(jìn)口

腸道致病菌的選擇性分離、培養(yǎng)前腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)子檢測(cè)試盒20mg基質(zhì)金屬蛋白酶13檢測(cè)試盒matrixmetalloproteinase2

磺基羅丹明1015mg

草定(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 Nitrapyrin

Alkaline Agar用于分離霍亂弧菌皰疹病8型感染IgG抗體檢測(cè)試盒20mg基質(zhì)金屬蛋白酶2檢測(cè)試盒matrixmetalloproteinase3