熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人干細(xì)胞因子受體(SCFR)ELISA試劑盒EGF Receptor Antibody100 ul

人金葡菌腸毒素(SE)ELISA試劑盒 EGF Receptor Antibody100 ul

人葡萄球菌蛋白A(SPA)ELISA試劑盒 Myc-Tag (9B11) Mouse mAb (Alexa Fluor? 647 Conjugate)300 ul

人抗SS-B/La抗體ELISA試劑盒Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) Antibody100 ul

人血清白蛋白(HSA)ELISA試劑盒Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) Antibody300 ul

人鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCCAg)ELISA試劑盒Phospho-EGF Receptor (Tyr992) Antibody100 ul

人鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原2(SCCAg-2)ELISA試劑盒Phospho-EGF Receptor (Tyr992) Antibody20 ul

人脾臟酪氨酸激酶(Syk)ELISA試劑盒 Phospho-EGF Receptor (Tyr992) Antibody300 ul
馬內(nèi)菲青霉探針法熒光定量PCR試劑盒大鼠內(nèi)皮素受體A0.313-20ng/mlS100A13|S100 calcium binding protein A13|S100 calcium-binding protein A13protein S100-A13|S100 calcium-binding protein A13

大鼠內(nèi)皮素1(ET-1)Elisa kit1.563-100ng/mlSAA2|Serum amyloid A-2 protein(SAA2)

大鼠緩激肽酶聯(lián)免疫分析（BK）ELISA Kit78.125-5000pg/mlSalusin α

大鼠抵抗素(Resistin)Elisa kit0.156-10ng/mlsCD14(Soluble Cluster of Differentiation14)|CD14|CD14 antigen|CD14 molecule|monocyte differentiation antigen CD14|Myeloid cell-specific leucine-rich glycoprotein

大鼠催乳素(PRL)0.313-20mIU/mlMGC117378|TRAP|TrATPase|tartrate resistant acid phosphatase 5|tartrate-resistant acid ATPase

大鼠促生長(zhǎng)激素釋放激素(GRH)1.25-80ng/mlSCG2|CHGC|EM66|SN|SgII|Chromogranin-C|Secretogranin-2

大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)0.625-40ng/mlSDC3|N-Syndecan|KIAA0468|N-syndecan|SDCN|SYND3syndecan proteoglycan 3|syndecan 3|syndecan 3(N-syndecan)|syndecan neural type|syndecan-3

大鼠促卵泡素(FSH)1.563-100ng/mlSDC4|Amphiglycan|Ryudocan|amphiglycan|Amphiglycan|MGC22217|ryudocan|Ryudocan core protein|SYND4ryudocan amphiglycan|syndecan 4|syndecan 4(amphiglycan|ryudocan)|syndecan proteoglycan 4|syndecan-4

大鼠雌二醇受體（ER）0.156-10ng/mlSDF-1|CXCL12(Stromal Cell Derived Factor 1)|PBSF|hIRH|hSDF-1|SCYB12|SDF1A|SDF1B|SDF1|SDF-1b|TLSF|TLSF-a|TLSF-b|IRH|SDF-1a|TPAR1|chemokine(C-X-C motif) ligand 12|C-X-C motif chemokine 12|Intercrine reduced in hepatomas|Pre-B cell growth-stimulating factor

大鼠心鈉肽Pro-ANP(1-98)0.313-20ng/mlSDH

大鼠大內(nèi)皮素(BigET)0.313-20nmol/mlsdLDL

大鼠降鈣素(CT)0.156-10ng/mlSec23b|SEC23-related protein B|SEC23B

大鼠骨鈣素(OT)ELISA Kit78-5000pg/mlSELL|TQ1|Lymph node homing receptor|Leukocyte-endothelial cell adhesion molecule 1(LECAM1)|Leukocyte surface antigen Leu-8|gp90-MEL|CD62 antigen-like family member L|Leukocyte adhesion molecule 1(LAM-1)|CD62L

大鼠促甲狀腺素(TSH)0.156-10ng/mlSEMA7A|CD108|H-Sema-L|Sema7A|SEMAL|CD108 antigen|CD108MGC126696|CDW108|CDw108|H-SEMA-K1|H-Sema-L|JMH|JMH blood group antigen|John-Milton-Hargen human blood group Ag|sema domain|immunoglobulin domain(Ig)|and GPI membrane anchor|(semaphorin)7A|sema domain|immunoglobulin domain(Ig)|and GPI membrane anchor|(semaphorin)7A(JMH blood group)|sema domain|immunoglobulin domain(Ig)|and GPI membrane anchor|7A|Sema K1|Sema L|SEMAK1|SEMALJohn Milton Hagen blood group H-Sema K1|semaphorin 7A|GPI membrane anchor(John Milton Hagen blood group)|semaphorin K1|semaphorin L|semaphorin-7A|semaphorin-K1|Semaphorin-K1|semaphorin-L|Semaphorin-L

大鼠皮質(zhì)醇(Cortisol)ELISA Kit0.625-40ng/mlSEPCR|PROCR

Ginsenoside Rg3胰島素樣生長(zhǎng)因子1檢測(cè)試劑盒20mg

馬來非尼拉敏 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR Pheniramine Maleate

促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 SCN2B 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)1000mL/瓶

MF/MPF(Human maturation promoting factor) ELISA Kit  人促有絲分裂子CAS號(hào)：1825910環(huán)氧合酶2檢測(cè)試盒1KUHuman/人Elisa試盒31364428

Ginsenoside Rg2胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體檢測(cè)試劑盒20mg

4'-丁氧基乙(>98.0%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(GC) 4'-Butoxyacetophenone 龜裂鏈霉菌 Bacillus mucilaginosus

促狀腺素釋放激素(TRH)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 ILT6 / LILRA3 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷5000mL/瓶

ATF1(Human activating transcription factor1) ELISA Kit  人轉(zhuǎn)錄子抗體1CAS號(hào)：1823692核糖1,5二羧化酶；加氧酶檢測(cè)試盒5KUHuman/人Elisa試盒31366253

EDANS鈉鹽5mg

萘乙酰(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 1-Naphthaleneacetamide

Agrin peptide  聚集蛋白抗原特價(jià)促銷高爾基體a甘露糖苷酶II檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒499810

98%100g5g乳脫酶（兔?。﹕oluble programmed death1

 亞鐵瓊脂 規(guī)格： 250g 用途： 用于厭氧亞還原梭狀芽孢桿菌的檢測(cè)（SN/T1071-2002）

Agtr1/AT1a(Angiotensin II receptor, type 1a)  血管組織血管緊張素Ⅱ1型受體抗原進(jìn)口、分裝N酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶I檢測(cè)試盒5gHuman/人Elisa試盒499810

98%,含二化硅穩(wěn)定劑500g25g蛋白酶（枯草桿）soluble programmed death Ligand 1

噻蟲啉(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：分析標(biāo)準(zhǔn)品 Thiacloprid

Lysine Iron Agar食品中沙門氏菌生化試驗(yàn)動(dòng)力蛋白1重鏈7檢測(cè)試盒20mg內(nèi)皮素1檢測(cè)試盒Urinecreatinine