PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱(chēng)TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以?xún)?nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

人穿孔素/成孔蛋白(PF/PFP)ELISA試劑盒Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (PerCP-Cy5.5? Conjugate)100 ul

人肽酰脯氨酰異構(gòu)酶(親環(huán)蛋白)樣1(PPIL1)ELISA試劑盒PSMA5 (T14) Antibody1 Kit

人肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPI)ELISA試劑盒PhosphoPlus?DARPP-32 (Thr34) Antibody Duet100 ul

人肽聚糖(PG)ELISA試劑盒 PSMA6 Antibody100 ul

人γ肽(Pγ)ELISA試劑盒AMPA Receptor (GluA2/3/4) Antibody100 ul

人多肽YY(Peptide-YY)ELISA試劑盒Phospho-Rac1/cdc42 (Ser71) Antibody20 ul

人肽-主要組織相容性復(fù)合體復(fù)合物(pMHC)ELISA試劑盒Phospho-Rac1/cdc42 (Ser71) Antibody100 ul

人胃蛋白酶原C(PG-C)ELISA試劑盒Cdc42 Antibody100 ul
豬圓環(huán)病毒3型探針?lè)晒舛縋CR試劑盒小鼠巨噬細(xì)胞克隆刺激因子(M-CSF)31.2-2000pg/mlApoptotic protease Mch-2|CASP-6|MCH2

小鼠L-Selectin31.25-2000pg/mlCCK B|CCK B receptor|CCK BR|CCK2 R|CCK2R|CCKBR|CCKRB|Cholecystokinin 2 receptor|cholecystokinin B receptor|GASR

小鼠白血病抑制因子(LIF)78.125-5000pg/mlCD226

小鼠瘦素(Leptin)0.156-10ng/mlNatural killer cell receptor 2B4|NK cell activation-inducing ligand|NAIL|NK cell type I receptor protein 2B4|NKR2B4|h2B4|SLAM family member 4|SLAMF4|Signaling lymphocytic activation molecule 4|CD244|CD244|2B4

小鼠苗條素受體(Leptin receptor)0.156-10ng/mlCD27 antigen|CD27L receptor|T-cell activation antigen CD27|T14|Tumor necrosis factor receptor superfamily member 7|CD27|CD27|TNFRSF7

小鼠層連蛋白(Laminin)0.156-10ng/ml8D6|8D6 antigen|8D6A|CD320|CD320 antigen|CD320 molecule|FDC signaling molecule 8D6|FDC SM 8D6|TCblR|Transcobalamin receptor

小鼠白介素-9(IL-9)62.5-4000pg/mlCD4|CD4 antigen|CD4 antigen(p55)|CD4 molecule|CD4 receptor|CD4mut|T-cell surface antigen T4|Leu-3|T-cell surface glycoprotein CD4

小鼠白介素6(IL-6)0.313-20ng/mlCD81|CD81 antigen|CD81 molecule|S5.7|TAPA1|Tetraspanin 28|Tspan 28|TSPAN28

小鼠白介素-5(IL-5)0.156-10ng/mlCD97

小鼠白介素4(IL-4)0.156-10ng/mlBOR| BOREALIN| CDCA8| Dasra B| hDasra B| PESCRG3

小鼠白介素3(IL-3)31.25-2000pg/mlC7orf17|CHCHD2|MNRR1|NS2TP

小鼠白介素2(IL-2)0.313-20ng/mlChondroitin sulfate synthase 2|CHPF|CHSY2|CSS2

小鼠白介素1α (IL-1α )78.125-5000pg/mlBatten disease protein|BATTENIN|BTS|CLN3|JNCL|Protein CLN3

小鼠白介素1α (IL-1α )0.313-20ng/mlCOLEC12|CLP1|NSR2|SCARA4|SRCL|collectin-12

小鼠白介素18(IL-18)Elisa Kit0.313-20ng/ml CNK|CNK homolog protein 1|CNK1|CNKSR1|Connector enhancer of KSR 1|Connector enhancer of KSR like|hCNK1|KSR

98%25g100ml4沒(méi)食子?；鼘巒atural deoxyribonucleic acid antibody

4,4'-二基二(>99.0%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：>99.0%(GC) 4,4'-Dimethoxybenzophenone 大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum

狀旁腺激素(PTH)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 CSEN / Calsenilin / KCNIP3 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)

VB6(Human Vitamin B6) ELISA Kit  人維生素B6CAS號(hào)：32239精氨激酶檢測(cè)試盒5KUHuman/人Elisa試盒3147646

acteoside血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa檢測(cè)試劑盒20mg

夏佛塔苷 訂購(gòu)|咨詢(xún) 規(guī)格： HPLC≥96%;20mg/支 人顆粒酶A(Gzms-A)ELISA試劑盒人96T0.156-10 ng/mL小鼠肌細(xì)胞生成素(MYOG)ELISA試劑盒，英文名：MYOG ELISA Kit

組織金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 PSME3 / PA28-gamma 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷(xiāo)1.01590.0500

sPselectin(Human soluble Pselectin) ELISA Kit  人可溶性P選擇素CAS號(hào)：31990赤霉素4檢測(cè)試盒10mgHuman/人Elisa試盒3147646

98%100g5g核糖核酶T1cyclooxygenase1

維生素E 訂購(gòu)|咨詢(xún) 規(guī)格： 200mg 人白介素25(IL25/C19orf10)ELISA試劑盒人96T15.6-1000 pg/mL小鼠骨成型蛋白受體Ⅱ(BMPR-Ⅱ)ELISA試劑盒，英文名：BMPR-Ⅱ ELISA Kit

PCA食品細(xì)菌總數(shù)測(cè)定和平板計(jì)數(shù)細(xì)胞角蛋白19片段檢測(cè)試盒20mg細(xì)菌脂蛋白檢測(cè)試盒Fibronectin

TQ2馬來(lái)酰亞 20mg

漏蘆甾;Rhapontisterone 規(guī)格： 20mg 訂購(gòu)|咨詢(xún) 5637, 人膀胱細(xì)胞

MIU Medium Base細(xì)菌的復(fù)合生化試驗(yàn)生長(zhǎng)子檢測(cè)試盒20mg纖連蛋白檢測(cè)試盒plasmin

TQ2 CPG *1000 ?*20mg

川牛膝對(duì)照藥材 訂購(gòu)|咨詢(xún) 規(guī)格： 1g B細(xì)胞粘附分子CD239抗體 CSF ELISA Kit 集落刺激因子(CSF)ELISA試劑盒

Lead Acetate Medium用于細(xì)菌的硫化氫試驗(yàn)糖原合成酶激酶3β檢測(cè)試盒20mg纖溶酶檢測(cè)試盒plasminogenactivatorinhibitor1
實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專(zhuān)用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。