PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

人高鐵血紅蛋白(MHB)ELISA試劑盒LRP6 (C5C7) Rabbit mAb20 ul

人變腎上腺素(MN) ELISA試劑盒LRP6 (C5C7) Rabbit mAb100 ul

人金屬硫蛋白(MT)ELISA試劑盒Met (D1C2) XP? Rabbit mAb (Alexa Fluor? 555 Conjugate)100 ul

人金屬硫蛋白2(MT2)ELISA試劑盒PTK7/CCK4 (D2Z1N) Rabbit mAb100 ul

人表面膜免疫球蛋白M(mIgM)ELISA試劑盒 Phospho-CDK2 (Thr160) Antibody100 ul

人表面膜免疫球蛋白D(mIgD)ELISA試劑盒 p190-B RhoGAP Antibody100 ul

人表面膜免疫球蛋白A(mIgA)ELISA試劑盒RhoGDI Antibody100 ul

人膜輔蛋白(MCP/CD46)ELISA試劑盒 Stat5 (D3N2B) Rabbit mAb20 ul
魏氏無(wú)綠藻探針法熒光定量PCR試劑盒小鼠17-羥-孕酮(17-ANP)31.25-2000pg/mlPDGFB|B chain|Becaplermin|FLJ12858|PDGF subunit B|PDGF2|PDGF-2|platelet-derived growth factor 2|Platelet-derived growth factor beta polypeptide|platelet-derived growth factor subunit B|platelet-derived growth factor|B chain

小鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)0.313-20ng/mlACA-IgA|anti-Cardiolipin Antibody IgA

小鼠甲狀腺素(T4)15.6-1000pg/mlFGF23|ADHR|FGF-23|fibroblast growth factor 23|HPDR2|HYPF|Phosphatonin|phosphatonin|PHPTC|tumor-derived hypophosphatemia inducing factor|Tumor-derived hypophosphatemia-inducing factor

小鼠游離甲狀腺素(Free-T4)0.312-20ng/mlNOS2|iNOS|NOS2A|HEP-NOS|I-NOS|Hepatocyte NOS|Peptidyl-cysteine S-nitrosylase NOS2|Inducible NO synthase|Inducible NOS|INOS|NOS|NOS|type II|NOS type II

小鼠游離三碘甲狀腺原氨酸(Free-T3)15.625-1000pg/mlInhba|Activin beta-A chain|Erythroid differentiation protein(EDF)

小鼠新生甲狀腺素(NN-T4)3.125-200ng/mlACA-IgG|anti-Cardiolipin Antibody IgG

小鼠胰島素(Insulin)31.25-2000pg/mlNpy(Neuropeptide Y)|PYY4|170 kDa melanoma membrane-bound gelatinase|DPPIV|FAPA|Fibroblast activation protein alpha|fibroblast activation protein|alpha|Integral membrane serine protease|seprase

小鼠C-肽(C-Peptide)78.125-5000pg/mlGip|(gastric inhibitory polypeptide)|Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide|Incretin

小鼠促腎上腺激素皮質(zhì)激素(Mouse ATH)46.875-3000pg/mlEng|Endoglin|CD105|END|HHT1|ORW|ORW1

小鼠絨毛促性腺激素(HCG)0.156-10ng/mlLdlr|Low-density lipoprotein receptor|FH|FHC|LDL receptor|LDLCQ2|low density lipoprotein receptor|low-density lipoprotein receptor class A domain-containing protein 3

小鼠促黃體激素(LH)0.156-10ng/mlΑfp(Alpha-Fetoprotein)|AFP|FETA|HPAFP|oralpha fetal protein

小鼠促卵泡生長(zhǎng)激素(Mouse FSH)3.125-200ng/mlACA-IgM|anti-Cardiolipin Antibody IgM

小鼠促乳素(Prolactin)15.625-1000pg/mlFGF15|Fibroblast growth factor 15

小鼠CD30配體(sCD30 L)0.156-10ng/mlPOSTN|OSF-2|Periostin|OSF2|POSTN

desphenol羥乙基頭孢哌酮furolactone0.78-50ng/mlOlr1|LOX-1|LOX1|CLEC8A|SCARE1|SR-E1|SLOX1|C-type lectin domain family 8 member A|Lectin-like oxidized LDL receptor 1|Lectin-like oxLDL receptor 1|Lectin-type oxidized LDL receptor 1|ox LDL receptor 1|LOXIN|oxidised low density lipoprotein(lectin-like) receptor 1|oxidized low-density lipoprotein receptor 1|Ox-LDL receptor 1|scavenger receptor class E|member 1

Camptothecine血栓前體蛋白檢測(cè)試劑盒20mg

羅庫(kù)銨 質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,EP6.0 Rocuronium Bromide 沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS瓊脂） 規(guī)格： 250g 用途： 用于分離培養(yǎng)沙門氏菌(傷寒沙門氏菌除外) (GB13091-91，ISO標(biāo)準(zhǔn))。

細(xì)胞間粘附分子1(ICAM1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 EPDR1 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷1.13825.0500

antiCMV IgM(Human anticytomegalovirus IgM antibody) ELISA Kit  人抗巨細(xì)胞病抗體IgMCAS號(hào)：18756二?；视王；D(zhuǎn)移酶檢測(cè)試盒1gHuman/人Elisa試盒31543756

血栓素A2檢測(cè)試劑盒20mg

甲芬那  英文名稱：Mefenamic acid   保存：-20℃   規(guī)格：100mg 化核糖體蛋白S6激酶家族RSK3抗體

細(xì)胞間粘附分子2(ICAM2)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 Vasoactive intestinal peptide / VIP 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)1.05454.0500

antitox IgM(Human antitoxoplasma IgG antibody) ELISA Kit  人抗弓形體IgM抗體CAS號(hào)：18601馬鈴薯病X檢測(cè)試盒500mgHuman/人Elisa試盒31558404

TF220mg

托品(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：>98% Tropic acid 粗狀假絲酵母 Candida valida不動(dòng)桿菌 Acinetobacter sp.

MAPK1/2  絲裂原活化蛋白激酶（抗原）進(jìn)口、原裝糖代謝調(diào)節(jié)蛋白檢測(cè)試盒500gHuman/人Elisa試盒50492223

TF2 20mg

大皂角  英文名稱：Gleditsia   保存：-20℃   規(guī)格：1g 化細(xì)胞核因子p50/k基因結(jié)合核因子抗體  

MAPKK2  絲裂原活化蛋白激酶激酶現(xiàn)貨供應(yīng)化糖代謝調(diào)節(jié)蛋白檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒5049616

TF1琥珀酰亞20mg

五味子甲素 訂購(gòu)|咨詢 規(guī)格： HPLC≥98%，20mg/vial 人血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13/vWF-cp)ELISA試劑盒人96T0.78-50 ng/mL小鼠色素上皮衍生因子(PEDF)ELISA試劑盒，英文名：PEDF ELISA Kit

特價(jià)促銷二酯酶1檢測(cè)試盒5gHuman/人Elisa試盒5049616
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。