上海邦景實業(yè)有限公司
主營產(chǎn)品: PCR檢測試劑盒, ELISA試劑盒, 細(xì)胞, 科研抗體, 中藥標(biāo)準(zhǔn)品
邦景多瘤病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
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主營產(chǎn)品
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標(biāo)記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時,內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。
PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途,下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號 |
多瘤病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 | Polyoma Virus(Py), | BJP63975 |
熒光定量PCR原理:
產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。
一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,重現(xiàn)性最好的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
實驗過程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此,擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
6.產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。
人胎盤核糖核酸抑止劑(HPRI)ELISA試劑盒 Phospho-Shc (Tyr317) Antibody100 ul
人胎盤蛋白(PP)ELISA試劑盒 CD16 (D1N9L) Rabbit mAb100 ul
人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)ELISA試劑盒 Shc Antibody100 ul
人胎盤催乳素(HPL)ELISA試劑盒 Calnexin Antibody100 ul
人胎盤生長因子(PLGF)ELISA試劑盒Phospho-Shc (Tyr239/240) Antibody20 ul
人P鈣黏蛋白/胎盤鈣黏蛋白(P-cad)ELISA試劑盒Phospho-Shc (Tyr239/240) Antibody100 ul
人垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)ELISA試劑盒PPARγ (C26H12) Rabbit mAb20 ul
人色素上皮衍生因子(PEDF)ELISA試劑盒PPARγ (C26H12) Rabbit mAb100 ul
多瘤病毒探針法熒光定量PCR試劑盒小鼠微量白蛋白尿(ALB)1.563-100ng/mlAAG4|Apo J|APOJ|ApoJalpha|ApoJbeta|Apolipoprotein J|CLI|CLU|clusterin|Complement cytolysis inhibitor|Ku70 binding protein 1|KUB1|NA1|NA2|SGP 2|SGP2|SP 40|TRPM 2|TRPM2
小鼠抗核抗體(ANA)15.6-1000pg/mlCCL1
小鼠Apelin-120.156-10ng/mlCD19|Leu-12|B4|B-lymphocyte antigen CD19|B-lymphocyte surface antigen B4|CD19 antigen|CD19 molecule|CVID3|Differentiation antigen CD19|MGC12802|T-cell surface antigen Leu-12
小鼠細(xì)胞色素P45078.125-5000pg/mlATP-binding cassette sub-family A member 13|ABCA13
小鼠精氨酸加壓素78-5000pg/ml IL-17RA
小鼠骨成型蛋白質(zhì)2(BMP-2)78.125-5000pg/mlHD6|HDAC6|histone deacetylase 6|JM21|KIAA0901
小鼠骨成型蛋白質(zhì)3(BMP-3)0.156-10ng/mlUbiquitin Specific Peptidase18
小鼠骨成型蛋白質(zhì)4(BMP-4)0.156-10ng/mlHDAC
小鼠骨成型蛋白質(zhì)6(BMP-6)0.78-50mIU/mlNAG
小鼠沙眼衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)78.125-5000pg/mlBeta-defensin 105|Beta-defensin 5|BD-5|DEFB-5|Defensin|beta 105|DEFB105A|BD5|DEFB105|DEFB5|DEFB105B
小鼠FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)0.313-20ng/mlSoluble scavenger receptor cysteine-rich domain-containing protein SSC5D
小鼠膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)78.125-5000pg/mlFoxj1|FKHL13|HFH-4|HFH4|fork head homologue 4|forkhead transcription factor HFH-4|forkhead-like 13|forkhead-related protein FKHL13|hepatocyte nuclear factor 3 forkhead homolog 4|forkhead box J1
小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子9 FGF9 31.25-2000ng/mlIS|indoxyl sulfate|serum indoxyl sulfate
小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子-6 FGF60.313-20ng/ml27 kDa heat shock protein-associated protein 1|Protein associated with small stress protein 1|ASS1
小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子-4 FGF431.25-2000pg/mlHHO.C1|homeobox B7|Hox 2.3|HOX2|HOX2C|HOXB7
Arctiin牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1檢測試劑盒20mg
肉豆蔻(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥95%,標(biāo)準(zhǔn)品 Myristicin
Tubeimoside I芐氟噻嗪標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:規(guī)格:人蛋白激酶Bα(PKBα)Polyclonal Antibody 0.2ml
Hyp(Human hydroxyproline) ELISA Kit 人羥脯氨CAS號:151615還原糖檢測試盒500mgHuman/人Elisa試盒31432458
98%25g5g環(huán)五味子素40487421antithymocyte globulin
人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞英文名稱:MT-4
Arctiin鹽奧布卡因標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:規(guī)格:人和肽素(CPP)Polyclonal Antibody 0.2ml
NO(Human nitric oxide) ELISA Kit 人一氧化氮CAS號:34584激動素檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒31432469
TQ4 CPG *1000 ?*20mg
除草標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=5%) 質(zhì)量規(guī)格:10μg/ml,u=5% Nitrofen solution
HCVNS3 型肝炎病NS3(抗原)進(jìn)口、分裝15deoxy前列腺素J2檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒50306
TQ4 CPG *500 ?*20mg
無翅型MMTV整合位點家族成員2(WNT2)重組蛋白英文名稱:Recombinant Wingless Type MMTV Integration Site Family, Member 2 (WNT2)
HCVNS4a 型肝炎病NS4a(抗原)進(jìn)口、原裝硬骨素檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒50306
TQ420mg
滅菌丹標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=2%) 質(zhì)量規(guī)格:100μg/ml,u=2% N-(Trichloromethylthio)phthalimide solution
Antibiotic Agar NO.4兩性霉素B等的效價測定高密度脂蛋白2b檢測試盒20mg天門冬氨氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試盒Homocysteicacid