定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人腦腸肽(BGP/Gehrelin)ELISA試劑盒Smad2/3 Antibody100 ul

人腦鈉素/腦鈉尿肽(BNP)ELISA試劑盒Smad2 (L16D3) Mouse mAb100 ul

人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)ELISA試劑盒Phospho-Smad2 (Ser245/250/255) Antibody100 ul

人血管舒緩激肽(BK)ELISA試劑盒 Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) (D85B4) XP? Rabbit mAb (PE Conjugate)100 ul

人骨特異性堿性磷酸酶B(ALP-B)ELISA試劑盒PKM1/2 (C5E6) Rabbit mAb300 ul

人骨涎蛋白(BSP)ELISA試劑盒Phospho-Smad2 (Ser465/467) (138D4) Rabbit mAb100 ul

人骨形成蛋白(BMPs)ELISA試劑盒Phospho-Smad2 (Ser465/467) (138D4) Rabbit mAb20 ul

人骨成型蛋白受體Ⅱ(BMPR-Ⅱ)ELISA試劑盒Phospho-Smad2 (Ser465/467) (138D4) Rabbit mAb500 ul
肉孢子蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒酮洛芬0.156-10ng/mlFABP1|FABPL|Fatty acid binding protein 1|L FABP

酮洛芬(標(biāo)準(zhǔn)品)15.6-1000pg/mlA FABP|AFABP|ALBP|aP2|FABP4|Fatty acid binding protein 4

富馬酸酮替芬0.156-10ng/mlCYB5RP|Cytochrome b5 related protein|FADS3|fatty acid desaturase 3|LLCDL3

富馬酸酮替芬(標(biāo)準(zhǔn)品)0.156-10ng/mlD6D|Delta(6) desaturase|Delta(6) fatty acid desaturase|DES6|FADS2|FADSD6|fatty acid desaturase 2|LLCDL2|SLL0262|TU13

酮咯酸78-5000pg/mlMAP1LC3A|Apg8|APG8a|Apg8p3|ATG8E|MAP1ALC3|MLP3A|ATG8E|Autophagy-related protein LC3 A|Autophagy-related ubiquitin-like modifier LC3 A|LC3|LC3A|lc3-i|ii|MAP1A|1B light chain 3 A|MAP1ALC3MAP1A|MAP1B LC3 A|MAP1BLC3MAP1A|MAP1B light chain 3 A|microtubule-associated protein 1 light chain 3 alphaMAP1 light chain 3-like protein 1|microtubule-associated proteins 1A|1B light chain 3|microtubule-associated proteins 1A|1B light chain 3A

來氟米特1.563-100ng/mlHistamine

來氟米特（標(biāo)準(zhǔn)品）0.312-20ng/mlSirt2|SIR2L2|sirtuin 2|sirtuin type 2|NAD-dependent deacetylase sirtuin-2|SIR2-like protein 2

左氧氟沙星3.125-200pg/mlMyosin heavy chain 7|Myosin heavy chain slow isoform|MyHC-slow|Myosin heavy chain|cardiac muscle beta isoform|MyHC-beta

左氧氟沙星（標(biāo)準(zhǔn)品）23.438-1500pg/mlTnnt3|Troponin T|fast skeletal muscle|TnTf|Beta-TnTF|Fast skeletal muscle troponin T|fTnT

氯諾昔康0.625-40ng/mlCMLC-1|MLC1F|MLC3F|A1 catalytic|A2 catalytic|fast skeletal myosin alkali light chain 1|myosin|light polypeptide 1|alkali|skeletal|fast

氯諾昔康(標(biāo)準(zhǔn)品)15.6-1000pg/mlNaMN adenylyltransferase 1|NMNAT1|PNAT 1|PNAT1

洛沙坦鉀/氯沙坦鉀0.156-10ng/mlFOXO3(Forkhead box protein O3)|AF6q21|FKHRL1|FKHRL1P2|FOXO3A|forkhead box O3|Forkhead in rhabdomyosarcoma-like 1

洛沙坦鉀/氯沙坦鉀7.813-500pg/mlM-CSF|MCSF|CSF1|CSF-1

馬賽替尼7.813-500pg/mlPCT(Procalcitonin)

美西林/氮脒青霉素15.6-1000pg/mlLGR-5

98%10g25g白花前胡丁素，(+)川白芷內(nèi)13609671tyrosine kinase2

瓊脂糖(Biowest,電泳級);西班牙瓊脂糖 質(zhì)量規(guī)格：進(jìn)口原裝Biowest 111860;電泳級 Agarose

Rhamnosylvitexin碳鈣標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人胎盤堿性酶(ALPP)ELISA試劑盒 0.2ml

TXA2(Human Thromboxane A2) ELISA Kit  人血栓素A2CAS號：環(huán)沙星雜質(zhì)B脂肪去飽和酶檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒320310

Piefeltarraenin ⅠB新生狀腺素檢測試劑盒20mg

去氫木香內(nèi)酯 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 糖基脂酰肌醇錨連接蛋白1抗體 RNASET2 ELISA Kit 核糖核酶T2(RNASET2)ELISA試劑盒

Rap鳥嘌呤核苷交換因子1(RAPGEF1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)重組人 DUSP3 / VHR 蛋白現(xiàn)貨促銷1.01282.0500

HbH(Human Hemoglobin H) ELISA Kit  人血紅蛋白HCAS號：環(huán)沙星雜質(zhì)ⅠN酰葡糖胺檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒320310

98%10mg100g對硝基基αD葡萄糖苷Coxsackie virus A16 IgG

9-(甲基)丫啶(>98.0%(HPLC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(HPLC)(T) 9-(Bromomethyl)acridine

特價促銷肝細(xì)胞核子1β檢測試盒25gMouse/小鼠Elisa試盒50982133

(ZDEVD)2R11020mg

 泡盛曲霉 Aspergillus awamori3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)

進(jìn)口、分裝胰多肽檢測試盒5gMouse/小鼠Elisa試盒50982133

ZIETDAFC20mg

DBD-COCl [=4-(N,N-二甲基氨磺酰)-7-(N-甲酰甲基-N-甲氨基)-2,1,3-并惡二唑](>98.0%(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(T) DBD-COCl [=4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-(N-chloroformylmethyl-N-methylamino)-2,1,3-benzoxadiazole]

進(jìn)口、原裝氧化三胺檢測試盒100gMouse/小鼠Elisa試盒50998179