熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

豚鼠一氧化氮(NO)ELISA試劑盒Dicer Antibody100 ul

豚鼠單核細(xì)胞趨化蛋白4(MCP-4/CCL13)ELISA試劑盒 Drosha (D28B1) Rabbit mAb20 ul

豚鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)ELISA試劑盒Drosha (D28B1) Rabbit mAb100 ul

豚鼠主要組織相容性復(fù)合體(MHC/GPLA)ELISA試劑盒CaMKI-δ Antibody100 ul

豚鼠過(guò)氧化脂質(zhì)/乳過(guò)氧化物酶(LPO)ELISA試劑盒 Neuropilin-2 (D39A5) XP? Rabbit mAb20 ul

豚鼠白三烯D4(LTD4)ELISA試劑盒 Neuropilin-2 (D39A5) XP? Rabbit mAb100 ul

豚鼠白三烯B4(LTB4)ELISA試劑盒 GST (26H1) Mouse mAb (Alexa Fluor? 488 Conjugate)100 ul

豚鼠鉤端螺旋體IgG(Lebtospira)ELISA試劑盒GSTP1 (3F2) Mouse mAb100 ul
偽中間型葡萄球菌探針法熒光定量PCR試劑盒甲基帕羅西汀0.156-10ng/mlInsl3|Ley I-L|RLF|RLNL|insulin-like 3|insulin-like 3(Leydig cell)|leydig insulin -like hormone|leydig insulin -like peptide|Leydig insulin-like peptide|Ley-I-L|MGC119818|MGC119819|Relaxin-like factor|relaxin-like factor b|RLFley-I-L|RLNL

硫酸頭孢喹諾78.125-5000pg/mlGusb|Beta-G1|MPS7|beta-D-glucuronidase|beta-G1|Beta-G1|beta-glucuronidase|BG|EC 3.2.1.31|FLJ39445|glucuronidase|beta|MPS7

頭孢噻呋鈉0.78-50ng/mlGpt|Glutamic--pyruvic transaminase 1|Glutamate pyruvate transaminase 1(GPT 1)|Glutamic--alanine transaminase 1|

頭孢噻呋鈉(標(biāo)準(zhǔn)品)15.625-1000pg/mlCav-1|CAV1|MSTP085|VIP21|CAV|caveolae protein|22kD|caveolin 1|caveolae protein|22kDa|cell growth-inhibiting protein 32|MSTP085

硫氰酸鈉78-5000pg/mlLipf|Lingual lipase|LIPF(Lipase|Gastric)|GL|Gastric lipase|Gastric triacylglycerol lipase

5'-三磷酸胞苷二鈉鹽(二水)1.56-100ng/mlPrss2|PRSS2|Tesp4|TRY8|Trypsinogen 20|Anionic trypsinogen|protease serine 2 preproprotein|protease|serine|2(trypsin 2)|protease|serine|2|preproprotein|Serine protease 2|TRY2TRY8|TRYP2|trypsin 2|Trypsin II|trypsin-2|trypsinogen 2

伏格列波糖0.312-20ng/mlCrhr2|Corticotropin-releasing hormone receptor 2(CRH-R-2|CRH-R2)|

伏格列波糖(標(biāo)準(zhǔn)品)31.2-2000mIU/mlCat|Cas1|CAT|Cs-1|catalase|EC 1.11.1.6|MGC138422|MGC138424

克里唑啼尼;克里唑替尼,Crizotinib0.78-50ng/mlPon1|ESA|K-45|A-esterase 1|Aromatic esterase 1|arylesterase B-type|ESAesterase A|K-45|MVCD5|paraoxonase 1|PON 1|PONparaoxonase B-type|serum aryldiakylphosphatase|Serum aryldialkylphosphatase 1|serum paraoxonase|arylesterase 1

BMS 5826640.312-20ng/mlMat1a|AMS1|MATA1|AdoMet synthase 1|S-adenosylmethionine synthase isoform type-1|Methionine adenosyltransferase 1

龍膽二糖0.313-20ng/mlAnxa5|Lipocortin V|Endonexin II|Calphobindin I(CBP-I)|Annexin-5|Thromboplastin inhibitor|Placental anticoagulant protein I(PAP-I)|Placental anticoagulant protein 4(PP4)|Vascular anticoagulant-alpha(VAC-alpha)|Anchorin CII|Annexin V|ANX5|ANXA5|ANXV|Anchorin CII|annexin A5|Annexin V|annexin-5|Annexin-5|ANX5|Calphobindin I|Endonexin II|ENX2CBP-I|Lipocortin V|PAP-I|Placental anticoagulant protein 4|Placental anticoagulant protein I|PP4|Thromboplastin inhibitor|VAC-alpha|Vascular anticoagulant-alpha

鹽酸異丙腎上腺素(標(biāo)準(zhǔn)品)0.313-20ng/mlAGE|N-acylglucosamine 2-epimerase|Renbp|GlcNAc 2-epimerase|N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase|Renin-binding protein|RnBP

鹽酸異丙腎上腺素(進(jìn)口)78.125-5000pg/mlCtsk

鹽酸異丙腎上腺素（國(guó)產(chǎn))0.156-10ng/mlIGFBP-6|IGFBP6|IBP6

西洛多辛0.156-10ng/mlPenk|Proenkephalin-A

99%25g25g(+)花旗松素glypican 3

 沙門氏志賀氏屬瓊脂培養(yǎng)基/SS瓊脂/Salmonella Shigella Agar沙門氏菌屬和志賀氏菌屬的分離培養(yǎng)250克國(guó)產(chǎn)/進(jìn)口

FMS樣酪氨激酶3(Flt3)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 HMGB1 / HMG1 蛋白 (His 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)1.12535.0500

人血清淀粉樣蛋白A（SAA）ANKS1B/AIDA1  β淀粉樣蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白1抗體規(guī)格:96T/48TCefepime Hydrochloride規(guī)格:100mg補(bǔ)體片段3c檢測(cè)試盒20mg大鼠狀腺成纖維細(xì)胞1x10^6cells

98%100g1g防己諾林; 粉防己素; 漢防己素; 去粉防己Phospholipase Cγ1

無(wú)水鈉 質(zhì)量規(guī)格：AR,≥99.8% Sodium carbonate anhydrous

中性粒細(xì)胞激活蛋白3(NAP3)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 IL1R1 / CD121a 蛋白現(xiàn)貨促銷1.10658.0500

Human soluble fibrin monomer complex,SFMC ELISA Kit  人可溶性血纖蛋白單體復(fù)合物CAS號(hào)：右旋糖酐分子量D7ω3脂肪脫氫酶檢測(cè)試盒5mgHuman/人Elisa試盒3222477

鈣熒光探針Rhod2, AM 20mg

2-萘甲酰(>98.0%(GC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(GC)(T) 2-Naphthoyl Chloride

高端化學(xué), 脂質(zhì)體2000

鈣熒光探針Rhod2, AM 20mg

地耳草 訂購(gòu)|咨詢 規(guī)格： 1g 白細(xì)胞介素-13受體a2抗體 IL2 ELISA Kit 白介素2(IL2)ELISA試劑盒

高端化學(xué), 鈹試II

鈣熒光探針Quin220mg

氨蝶啶  質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR Triamterene 固合酶(ALDOS)重組蛋白英文名稱：Recombinant Aldosterone Synthase (ALDOS)

LIM Medium用于鏈球菌的分離培養(yǎng)；細(xì)菌的賴氨、哚和動(dòng)力復(fù)合生化試驗(yàn)恙蟲病IgG抗體檢測(cè)試盒20mg禽流感病抗原檢測(cè)試盒NaKATPase