熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

魚骨鈣素/骨谷氨酸蛋白(OT/BGP)ELISA試劑盒LRP6 (C47E12) Rabbit mAb20 ul

魚類超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)ELISA試劑盒LRP6 (C47E12) Rabbit mAb100 ul

魚類皮質(zhì)醇(Cortisol)ELISA試劑盒TCF8/ZEB1 (D80D3) Rabbit mAb20 ul

大腸桿菌宿主殘留蛋白(E.coli P)ELISA試劑盒 TCF8/ZEB1 (D80D3) Rabbit mAb100 ul

馬主要組織相容性復(fù)合體(MHC/ELA)ELISA試劑盒SHP-2 (D50F2) Rabbit mAb20 ul

馬免疫球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒SHP-2 (D50F2) Rabbit mAb100 ul

馬生長激素(GH)ELISA試劑盒Phospho-eIF2α (Ser51) (D9G8) XP? Rabbit mAb20 ul

馬β內(nèi)啡肽(β-EP)ELISA試劑盒Phospho-eIF2α (Ser51) (D9G8) XP? Rabbit mAb100 ul
念珠狀鏈桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒千金藤素(標(biāo)準(zhǔn)品)125-8000pg/mlPTGS2|COX-2(Prostaglandin Endoperoxide Synthase 2)|PGHS-2|PHS-II|PTGS2|cyclooxygenase 2b|cyclooxygenase-2|GRIPGHS|Cox-2|PGG|HS|PGH synthase 2|PHS II|PHS-2|prostaglandin G|H synthase 2|prostaglandin G|H synthase and cyclooxygenase|Prostaglandin H2 synthase 2|Prostaglandin-endoperoxide synthase 2

醋酸卡泊芬凈0.78-50ng/mlPrdx5|ACR1|AOEB166|AOPP|PMP20|PRXV|Peroxisomal antioxidant enzyme|Alu corepressor 1|Alu co-repressor 1|Antioxidant enzyme B166|Peroxiredoxin V|B166|Liver tissue 2D-page spot 71B|peroxiredoxin 5|peroxiredoxin-5|mitochondrial|PLPThioredoxin peroxidase PMP20|PRDX6|prx-V|SBBI10|Thioredoxin reductase|TPx type VI

小白菊內(nèi)酯3.125-200ng/mlApoe(Apolipoprotein E )|Apo-E|apolipoprotein E3

小白菊內(nèi)酯31.2-2000pg/mlOprm1|M-OR-1|MOR-1|Ror-b|Mu-type opioid receptor|Opioid receptor B

利扎曲坦0.312-20ng/mlPfkm|GSD7|PFK-1|PFK-A|PFKM|PFKX|Phosphofructokinase-1|Phosphofructokinase-M|Phosphohexokinase|6-phosphofructokinase|muscle type|EC 2.7.1|6-phosphofructo-1-kinase|EC 2.7.1.11|GSD7|MGC8699|PFK1|PFKA|PFK-A|PFKX|Phosphofructo-1-kinase isozyme A|Phosphofructokinase 1|phosphofructokinase|muscle|phosphofructokinase|polypeptide X|phosphofructokinase-M|Phosphofructokinase-M|phosphohexokinase|Phosphohexokinase

地瑞那韋乙醇鹽78-5000pg/mlGpi

維拉佐酮3.125-200ng/mlTtr|PALB|TBPA|ATTR|Prealbumin|HsT2651|prealbumin|amyloidosis type I|thyroxine-binding prealbumin

達(dá)比加群1.563-100ng/mlProc(Protein C)|Coagulation Factor XIV|Vitamin K-dependent protein C|Autoprothrombin IIA|PROC|Protein C|Anticoagulant protein C|APC|Autoprothrombin IIA|Blood coagulation factor XIV|EC 3.4.21|EC 3.4.21.69|PC|PROC1|protein C(inactivator of coagulation factors Va and VIIIa)|vitamin K-dependent protein C

瑞格列奈0.312-20ng/mlTLR4|CD284|ARMD10|CD284 antigen|hTollhomolog of Drosophila toll|TOLL|toll-like receptor 4

瑞格列奈（標(biāo)準(zhǔn)品）0.156-10ng/mlXdh

D-阿拉伯糖1.56-100ng/mlLipc|LIPC|HTGL|Hepatic triacylglycerol lipase|HL|Hepatic lipase|Lipase member C

D-阿拉伯糖(標(biāo)準(zhǔn)品)0.312-20ng/mlPdha1|PDHE1-A type I

阿魏酸,松柏酸,反式阿魏酸7.8-500pg/mlHcrt|OX|PPORX|PPOX|Orexin|Hypocretin|Hcrt

阿魏酸(標(biāo)準(zhǔn)品)1.563-100ng/mlAgt|AGT|Angiotensin II|Angiotensinogen|Aogen|PAT|alpha-1 antiproteinase|antitrypsin|angiotensin II|angiotensinogen|angiotensinogen(serpin peptidase inhibitor|clade A|member 8)|ANHU|FLJ92595|FLJ97926|pre-angiotensinogen|serine(or cysteine) proteinase inhibitor|Serpin A8|SERPINA8angiotensin I

安石榴苷15.6-1000pg/mlCck

纖溶酶抗纖溶酶復(fù)合物檢測試劑盒20mg

XTT鈉鹽 質(zhì)量規(guī)格：>90%,進(jìn)分 XTT sodium salt 布氏桿菌 Lactobacillus buchneri釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

Eriocitrin卡維地洛系統(tǒng)適應(yīng)性混合物標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人Apelin(APLN)Polyclonal Antibody 0.2ml

Human Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor,TAFI ELISA Kit  人纖溶抑制子/凝血酶激活的纖溶抑制物CAS號：D鹽氨基葡萄糖5烯醇式酰莽草3合酶檢測試盒250mgHuman/人Elisa試盒32249357

Cichoric Acid纖溶酶原檢測試劑盒20mg

長春 訂購|咨詢 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 泛素激活酶E1抗體 Kim1 ELISA Kit 腎損傷分子1(Kim1)ELISA試劑盒

Eriodictyol卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人水通道蛋白9(AQP9)Polyclonal Antibody 0.2ml

Human platelet membrane glycoprotein II b III a,GP II b III a ELISA Kit  人血小板膜糖蛋白ⅡbⅢaCAS號：蚓激酶6果糖激酶檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒32249357

>98.0%(GC)100g25g尿酶cMyb

4-二甲基氨基肉桂(>98.0%(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(T) 4-Dimethylaminocinnamaldehyde

高端化學(xué), 中性樹膠

>98.0%(GC)500g100g酪氨脫羧酶SQSTM1p62

 小鼠肝星形細(xì)胞完全培養(yǎng)基TF-1(人血液白血病細(xì)胞)

高端化學(xué), 柯柏膠

鈣熒光探針Quest Fluo8?, AM20mg

2,3-萘二羧酐(>95.0%(GC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(GC)(T) 2,3-Naphthalenedicarboxylic Anhydride

高端化學(xué), 蟲膠