定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時熒光定量PCR：

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

羅漢果皂苷IVaPDE5 (P434) Antibody100 ul

3-O-D-葡萄糖(1→4)-[ L-鼠李糖(1→2)]-L-阿拉伯糖-23-羥基羽扇豆20(29)-烯-28–酸eEF1A (D10A5) Rabbit mAb100 ul

白頭翁皂苷BLCP1 (D1C3) Rabbit mAb100 ul

3-O-D-葡萄糖( 1→4)-[ L-鼠李糖(1→2)]-L-阿拉伯糖-常春藤配基- 28-O-鼠李糖(1→4)葡萄糖(1→6)葡萄糖苷RCC1 Antibody100 ul

3-O-D-葡萄糖( 1→4)-[ L-鼠李糖(1→2)]-L-阿拉伯糖-23-羥基羽扇豆20(29)-烯-28–酸- 28-O-鼠李糖(1→4)葡萄糖(1→6)葡萄糖苷Phospho-Rb (Ser780) (C84F6) Rabbit mAb100 ul

3-O-D-葡萄糖(1→3)-L-鼠李糖(1→2)-L-阿拉伯糖- 齊墩果酸–28-O-鼠李糖(1→4)葡萄糖(1→6)葡萄糖苷Phospho-eIF4B (Ser422) Antibody20 ul

補(bǔ)充中Phospho-eIF4B (Ser422) Antibody100 ul

常春藤苷CeIF4B Antibody20 ul
豬痘病毒探針法熒光定量PCR試劑盒1-酮戊二酸二鈉鹽(>98%,BR)312.5-20000pg/mlDRD3

氯化鋁，無水三氯化鋁0.156-10ng/mlDRD4

氫氧化鈣(>95%,BR)0.156-10ng/mlE-Cadherin|E-Cad|CDH1|Arc-1|CAD1|Cadherin-1|CD324|Cell-CAM120|ECAD|L-CAM|Uvomorulin|cadherin 1|E-cadherin(epithelial)

低粘度羥丙基纖維素6.25-400pg/mlEGR1|KROX24|NGFIA|ZNF225|AT225Transcription factor ETR103|early growth response 1|early growth response protein 1|EGR-1|G0S30|KROX24|KROX-24|Nerve growth factor-induced protein A|NGFI-ATranscription factor Zif268|TIS8|ZIF-268|Zinc finger protein Krox-24|ZNF225Zinc finger protein 225

L(+)酒石酸二鈉二水(>98%,BC )0.313-20ng/mlEGR2

亞硝酸鉀(>96%,BR)31.25-2000pg/mlEG-VEGF|PROK1|Prokineticin 1|EG-VEGF|EGVEGFblack mamba toxin-related protein|Endocrine-gland-derived vascular endothelial growth factor|Mambakine|PK1mambakine|PRK1prokineticin-1|PROK1|prokineticin 1

鹽酸吡哆胺(>98%,BC )0.625-40ng/mlEL(Endothelial lipase)

水楊酸鈉(>99%,USP)15.625-1000pg/mlSNCa|NACP|PARK1|PARK4|PD1|SNCA|Lewy body) 4|MGC110988|non A-beta component of AD amyloid|Non-A beta component of AD amyloid|non-A4 component of amyloid|Non-A4 component of amyloid precursor|PARK1|PARK4|synuclein|alpha(non A4 component of amyloid precursor)

3-(環(huán)己氨基 )-1-丙磺酸鈉(分子生物學(xué)級)15.625-1000pg/mlCXCL5|ENA-78|SCYB5|Epithelial Neutrophil Activating Peptide 78

血紅素(>95%,BR)39.063-2500pg/mlEP2|PGE receptor EP2 subtype|PGE2 receptor EP2 subtype|prostaglandin E receptor 2(subtype EP2)|53kD|prostaglandin E receptor 2(subtype EP2)|53kDa|prostaglandin E2 receptor EP2 subtype|Prostanoid EP2 receptor

聚乙二醇8000.156-10ng/mlEPCR|CCD41|CD201|PROCR|APC receptor|CCCA|CCD41centrosome-associated protein|CD201 antigen|centrocyclin|Endothelial cell protein C receptor|endothelial protein C receptor|EPCRMGC23024|protein C receptor|endothelial

炔雌醚;炔雌醇環(huán)戊醚0.313-20ng/mlERK1|MAPK3|P44ERK1|p44mapk|PRKM3|EC 2.7.11|ERK-1|ERK1p44-MAPK|ERT2|Extracellular signal-regulated kinase 1|extracellular signal-related kinase 1|HS44KDAP|HUMKER1A|Insulin-stimulated MAP2 kinase|MAP kinase 1|MAP kinase 3|MAP kinase isoform p44|MAPK 1|MAPK 3|MGC20180|Microtubule-associated protein 2 kinase|Mitogen-activated protein kinase 1|mitogen-activated protein kinase 3|p44erk1|P44ERK1|p44-ERK1|P44MAPK|p44mapk|PRKM3EC 2.7.11.24

磷酸二酯酶 (比活度：>20 U/mg，BC)0.781-50ng/ml ERK1|2

碘化丙啶(>95% (HPLC),BC)0.781-50ng/ml ERK2|ERT1|MAPK1|MAPK2|MAPK3|p41mapk|P42MAPK|p44erk1|p44mapk|PRKM1|PRKM2|PRKM3

十二烷基苯磺酸鈉(>95%,Tech Grade)15.625-1000pg/mlERN1

98%100g25g720070/20200ul手動單道可調(diào)式移液器(Dragonmed)Immunoglobulin G1

丁嘧脲;純品型;標(biāo)準(zhǔn)品;有證書 訂購|咨詢 規(guī)格： 0.1g CD299抗體 EXOSC2 ELISA Kit 外切酶體成分2(EXOSC2)ELISA試劑盒

Fraxin;Fraxoside; Paviin頭孢泊肟酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人種胎兒球蛋白/胎蛋白(AFP)Polyclonal Antibody 0.2ml

人D二聚體ZNRF1  鋅指/環(huán)指蛋白1抗體規(guī)格:96T/48TCephalexin規(guī)格:200mg促紅細(xì)胞生成素受體檢測試盒20mg大鼠乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞1x10^6cells

>98.0%(GC)25g1g720050/10100ul手動單道可調(diào)式移液器(Dragonmed)Immunoglobulin G

化天竺葵素 規(guī)格： HPLC≥98%;10mg 訂購|咨詢 ELISA Kit for Noradrenaline大鼠末端補(bǔ)體復(fù)合物C5b-9(TCC C5b-9)ELISA試劑盒，英文名：TCC C5b-9 ELISA Kit

內(nèi)皮細(xì)胞TEK酪氨激酶(Tie2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 FGF6 / FGF-6 蛋白現(xiàn)貨促銷1.00414.0500

Human Immunoglobulin M,IgM ELISA Kit   人免疫球蛋白MCAS號：L鹽組氨內(nèi)素檢測試盒500UHuman/人Elisa試盒32499642

Oxonol VI 20mg

甲菲啶(>95.0%(HPLC)(N)) 質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(HPLC)(N) Dimidium Bromide

高端化學(xué), 安息香

Oxonol V 20mg

 人心肌成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基BT-549(人腺管細(xì)胞)

高端化學(xué), 2萘

DiSBAC2(3) 20mg

7-(二甲基氨基)-4-三氟甲基香豆素(>97.0%(GC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>97.0%(GC)(T) 7-(Dimethylamino)-4-(trifluoromethyl)coumarin

高端化學(xué), 3叔丁基4羥基