定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

Pfu DNA聚合酶β-Tubulin (9F3) Rabbit mAb (Alexa Fluor? 647 Conjugate)100 ul

Taq Plus DNA聚合酶NUT (C52B1) Rabbit mAb500 ul

Long Taq DNA 聚合酶CD11c (3.9) Mouse mAb (APC Conjugate)100 ul

KOD DNA 聚合酶Integrin β5 (D24A5) Rabbit mAb20 ul

Fast Taq DNA 聚合酶Integrin β5 (D24A5) Rabbit mAb100 ul

Gold Taq DNA聚合酶RalBP1 (I33) Antibody100 ul

Hotstart TaqDNA聚合酶Nicastrin Antibody100 ul

Super TaqDNA聚合酶ALK (D5F3?) XP? Rabbit mAb20 ul
福賽斯坦納菌探針法熒光定量PCR試劑盒氯化鈰七水15.625-1000pg/mlGROγ|CXCL3|CINC-2|DCIP-1|GRO gamma|Dcip1|CINC-2b|GRO3|GRO3 oncogene|GROg|GROG|GRO-gamma|MIP2B|MIP-2b|MIP2-beta|SCYB3|Gm1960|chemokine(C-X-C motif) ligand 3|C-X-C motif chemokine 3|GRO-gamma(1-73)|Growth-regulated protein gamma|Macrophage inflammatory protein 2-beta|melanoma growth stimulatory activity gamma|MGSA gamma

D-阿拉伯糖醇(標(biāo)準(zhǔn)品)15.625-1000pg/mlGS

D-阿拉伯糖醇15.625-1000ng/mlGS(Gelsolin)|GSN|ADF|AGEL|Brevin|Actin-depolymerizing factor

三氯六氨絡(luò)鈷;六氨基氯化鈷0.313-20ng/mlGSTA1

米吐爾(>98%,BC)0.156-10ng/ml GSTP|GSTP1|GSTpi(Glutathione S Transferases Pi)|DFN7|FAEES3|deafness|X-linked 7|GST class-pi|GST3|DFN7|GSTP|GSTP1-1|PI|fatty acid ethyl ester synthase III|glutathione S-transferase P|glutathione S-transferase pi 1

鹽酸吡哆醛0.156-10ng/mlGSTT1|GSTθ1|GSTt1|GST class-theta-1|Glutathione transferase T1-1

硅油15.625-1000pg/mlGZMK|NK-tryptase-2|NK-Tryp-2|Fragmentin-3|Granzyme-3

溴化鈉0.313-20ng/mlHABP1|C1QBP(Hyaluronan Binding Protein 1)|gC1qBP|gC1qR|SF2p32|p32|Glycoprotein gC1qBP|HABP1p33|GC1q-R protein|C1q globular domain-binding protein|gC1Q-R|Hyaluronan-binding protein 1|Mitochondrial matrix protein p32|splicing factor SF2-associated protein

六偏磷酸鈉1.563-100ng/mlHbA1C|Glycosylated Hemoglobin|Hemoglobin A1c

無脂肪酸牛血清白蛋白15.625-1000pg/mlHBEGF|HB-EGF|HBEGF|Dtr|Dts|Hegfl|diphtheria toxin receptor(heparin-binding epidermal growth factor-like growthfactor)|DTRHEGFLdiphtheria toxin receptor(heparin-binding EGF-like growth factor)|DTS|DTSF|heparin-binding EGF-like growth factor|heparin-binding epidermal growth factor|proheparin-binding EGF-like growth factor

二羥基丙酮(>97%,BR)31.2-2000pg/mlHC II|Serpin D1|Heparin Cofactor II|HC2|HCF2|Heparin Cofactor II|LS2|HC2LS2|HCF2clade D(heparin cofactor)|member 1|HC-II|Heparin cofactor II|HLS2HCII|leuserpin 2|Protease inhibitor leuserpin-2|Serpin D1|serpin peptidase inhibitor|clade D(heparin cofactor)|member 1

心肌黃酶(>30U/mg,BR)0.156-10ng/mlHDAC2|YAF1|HD2|histone deacetylase 2|RPD3|transcriptional regulator homolog RPD3|YAF1|YY1-associated factor 1

水溶毛地黃皂苷0.313-20ng/mlHDGF|HuHGF|FLJ96580|hepatoma-derived growth factor|hepatoma-derived growth factor(high-mobility group protein 1-like)|High mobility group protein 1-like 2|HMG-1L2|HMG1L2DKFZp686J1764

DSP3.125-200ng/mlHDL

乙二胺四乙酸二鈉一鎂鹽15.625-1000pg/mlHepc(Hepcidin)|HAMP|HFE2B|LEAP1|PLTR|LEAP-1|hepcidin antimicrobial peptide|Putative liver tumor regressor|Liver-expressed antimicrobial peptide 1

98%10g5g711121210000/25μl opPette手動(dòng)固定移液器(Dragonmed)Annexin A1

瓊脂糖(Sigma) 質(zhì)量規(guī)格：Sigma原裝 Agarose

(+)-Bicuculline頭孢烯（Z）-異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人雙調(diào)蛋白(AREG)Polyclonal Antibody 0.2ml

Human Tissuetype Plasiminogen Actilyse,tPA ELISA Kit  人組織型纖溶酶原激活CAS號(hào)：L谷氨酰胺三尿苷檢測(cè)試盒100mgHuman/人Elisa試盒325508

98%100g25g711121200000/20μl opPette手動(dòng)固定移液器(Dragonmed)Mullerian Inhibiting Substance;AntiMullerian hormone

 小鼠真皮成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL

Isoquercitrin;Isoquercetin; Isoquercitroside頭孢烯規(guī)格：規(guī)格：人血管生長(zhǎng)素(ANG)Polyclonal Antibody 0.2ml

Human Tissue factor,IF ELISA Kit  人組織子CAS號(hào)：谷胱甘肽三鳥苷檢測(cè)試盒500mgHuman/人Elisa試盒325893

TMADPH20mg

增效;純品型;標(biāo)準(zhǔn)品;有證書 訂購|咨詢 規(guī)格： 0.1g γ氨基丁運(yùn)載蛋白3抗體 ALOX5 ELISA Kit 花生四-5-脂加氧酶(ALOX5)ELISA試劑盒

高端化學(xué), 2,9二基4,7二基1,10菲啰啉

MM 59520mg

薏苡仁  英文名稱：Coix seed   保存：-20℃   規(guī)格：2g 蛋白質(zhì)精氨甲基轉(zhuǎn)移酶1抗體

高端化學(xué), 并啉

97%100g5g對(duì)硝基基βD葡糖醛苷Syndecan 1

1,4-二氧基(>98.0%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(GC) 1,4-Diphenoxybenzene Poly-L-Lysine Solutiona(5mg/ml)規(guī)格：

高端化學(xué), 2，9二基1，10菲羅啉