柱式植物RNAout 2.0（含DNA酶)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

本產(chǎn)品是基因柱式植物 RNAOUT（CAT#:71203）與柱式 DNA 清除劑（CAT#:90318）整合后得到的升級(jí)產(chǎn)品，它解決了提取的植物總 RNA 中出現(xiàn)基因組 DNA 污染這一難題，提取的 RNA 通過(guò) PCR 驗(yàn)證不含基因組 DNA污染。該產(chǎn)品特點(diǎn)如下：

1. 操作簡(jiǎn)單快速，處理一個(gè)樣品只需要約十幾分鐘。

2. RNA 純度更高，平均 OD260/280 一般都在 2.0 左右，能夠有效去除大多數(shù)植物中的多糖污染。

3. 所提取 RNA 不含基因組 DNA 污染（電泳及 PCR 均檢測(cè)不到）。

4. 得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern 雜交、cDNA 合成等實(shí)驗(yàn)。

5. 性價(jià)比高于進(jìn)口的柱式植物 RNA 提取產(chǎn)品。

6. 本試劑盒方法提取不到總 RNA 中的 miRNA。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 大紙盒包裝 
柱式植物 RNAOUT 溶液 A LM71203a 50 mL 柱式植物 RNAOUT 溶液 B LM71203b 15 mL 柱式植物 RNAOUT 溶液 C LM71203c 50 mL 離心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 100 mL DNase 膜反應(yīng)液 90404a 2.5 mL RNase-free DNase（1U/uL） 90903 0.5 mL RNA 洗脫液 71207 10 mL 使用手冊(cè) 90404sc 1 份 

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，但 RNase-free DNase 和 DNase 膜反應(yīng)液需要-20℃保存，

有效期一年

自備試劑 氯仿 

使用方法 

1. 估算組織細(xì)胞的用量。每次微量提取一般需要 100-200 mg 植物葉片、或 50-100 mg 植物種子、或 200-500 mg 植物果實(shí)。

2. 樣品破碎：

1) 勻漿法：先將新鮮植物組織剪切成小塊(保存在 RNALOCKER 中的植物組織需用紙吸去 RNALOCKER 液體后再剪切成小塊)，放入 10-15 mL塑料離心管中，加入 1 mL 柱式植物 RNAOUT 溶液 A，然后用勻漿器勻漿 5-20 秒。勻漿時(shí)會(huì)產(chǎn)生泡沫，但不影響提取效果。

2) 液氮研磨法（適用于復(fù)雜，易降解樣品）：取適量新鮮植物組織放入含液氮的研缽中，迅速將組織研磨成粉末后，將粉末轉(zhuǎn)移到合適的塑料離心管中，加入 1 mL 柱式植物 RNAOUT 溶液 A，立即劇烈振蕩20 秒，充分混勻。

注意：溶解柱式植物 RNAout 溶液 A 沉淀。如果把柱式植物 RNAout溶液 A 放在 4℃放置，一段時(shí)間后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，此種情況下使用前必須放在 65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用。

3. 將勻漿物或研磨物轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 mL 塑料離心管中(可以不必轉(zhuǎn)移非液體的細(xì)胞碎片)。有的植物組織（比如果實(shí)）含有大量水份，勻漿液會(huì)多于 1 mL，轉(zhuǎn)移時(shí)也只取 1 mL。

4. 在離心管中加入0.3 mL的柱式植物RNAOUT溶液B和0.2 mL自備氯仿，在振蕩器上振蕩 30 秒混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。

5. 室溫 12000 rpm 離心 3-5 分鐘，兩相間將有約 5 毫米厚的細(xì)胞破碎物。

6. 將上清液(約 0.6 mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，下層有機(jī)相和中間層含有 DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取。好留下100 uL 上清液不取。

7. 加入跟上清液等體積的柱式植物 RNAOUT 溶液 C，充分顛倒混勻。如果有沉淀產(chǎn)生（對(duì)某些植物，屬于正?，F(xiàn)象），千萬(wàn)不要去掉沉淀，一定要把所有的混合物上柱。

8. 將一半的混合液（含沉淀物，如果有的話）轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12000rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

9. 將剩下的一半的混合液（含沉淀物，如果有的話）轉(zhuǎn)移到同一離心吸附柱中，12000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

10. 加 0.7 mL 通用洗柱液，12000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。再加0.3 mL 通用洗柱液，12000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。一般樣品如此洗滌兩次即可，但對(duì)于在第 7 步加入柱式植物 RNAOUT 溶液 C 后有沉淀產(chǎn)生的樣品，則需要洗三次，每次加入的通用洗滌液的量分別為0.4、0.3 和 0.3 mL，其他操作不變。

11. 12000 rpm 室溫離心 10 秒以便去除殘留液體。此步很重要，否則殘留的通用洗柱液會(huì)抑制后續(xù)反應(yīng)中 DNase 的活性。

12. 將 10 uL（10 U）的 RNase-free DNase 加入到 50 uL 37℃預(yù)熱的 DNA膜反應(yīng)液中，吹打混勻配制成 DNase 工作液。

13. 將 DNase 工作液在 37℃預(yù)熱 1 分鐘，然后全部加入到離心吸附柱中，室溫放置 5 分鐘。注意：5 分鐘一般足夠降解大多數(shù)情況下的 DNA 污染。如果 DNA 沒(méi)有徹底降解（可能由于樣品中殘留的雜質(zhì)抑制了 DNase 的活性），此步的保溫時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)到 10 分鐘或 15 分鐘。

14. 直接在離心吸附柱中加 0.7 mL 通用洗柱液，蓋上蓋后顛倒數(shù)次混勻。

15. 12000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

16. 再加 0.3 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

17. 12000 rpm 室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的乙醇（通用洗柱液中的成分）會(huì)影響 RNA 的使用。

18. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到 RNase-free收集管中，加入30-50 uL RNA洗脫液，室溫放置 1-2 分鐘。

19. 12000 rpm 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為 RNA 樣品。本產(chǎn)品提供的離心吸附柱吸附力較強(qiáng)，一次洗脫不能全部將膜上 RNA 洗下，如有必要，可以再加入 30-50 uL RNA 洗脫液一次。

20. 所得 RNA 溶液可以立即使用或存放于-80℃待用。如果要進(jìn)行甲醛變性電泳檢測(cè)。如果使用非變性膠電泳，則必須使用 RNAon 上樣液。千萬(wàn)不能使用 DNA 上樣液（因?yàn)樗话銢](méi)經(jīng)過(guò)去 RNase 處理）。