PCR法DNA探針生物素標(biāo)記試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)PCR 標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的 dNTP 進(jìn)行 PCR，最后得到的 PCR 產(chǎn)物 將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。本產(chǎn)品就是基于上述原理的基礎(chǔ)上開 發(fā)，它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。

2. 足夠 10 次 50 uL 體系的常規(guī) PCR（用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對(duì) 照反應(yīng)）和 5 次 50 uL 體系的標(biāo)記反應(yīng)。

3. 一次標(biāo)記可以得到ug級(jí)的雙鏈DNA探針或約700ng 的單鏈DNA探針， 足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。

4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。

5. A 型需自備含標(biāo)記核苷酸的 dNTP， B 和 C 型分別含生物素和地高辛標(biāo) 記的底物?？捎玫淖詡錁?biāo)記底物包括 fluorescein-dUTP、 hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。

6. 摻入率一般為 4-5%，有效降低了空間阻礙，檢測(cè)效果最佳。

7. 標(biāo)記探針可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位雜交、菌落和斑 點(diǎn)印跡雜交等分析。

8. 本產(chǎn)品足夠 5 次非標(biāo)記 PCR 和 5 次標(biāo)記 PCR（均指 50uL 體系）。
規(guī)格及成分 A 型成 份 編 號(hào) 十孔盒包裝
2×標(biāo)記專用 PCR Mix LM90604a 500uL(黃蓋)
dATP，10 mM each LM130912 50uL(白蓋)
dTTP，10 mM each LM130913 50uL(綠蓋)
dGTP，10 mM each LM130914 50uL(紅蓋)
dCTP，10 mM each LM130915 50uL(本色蓋)
超純水 LM100935 1 mL(藍(lán)蓋)
使用手冊(cè) LM90604sc 1 份
B 型（生物素）
成 份 編 號(hào) 十孔盒包裝
2×標(biāo)記專用 PCR Mix LM90604a 500 uL(黃蓋)
含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP，2mM 90604b 25 uL(綠色)
dNTP Mix，2 mM each 51208 50 uL(白蓋)
超純水 100935 1 mL(藍(lán)蓋)
使用手冊(cè) 90604sc 1 份
C 型（DIG）
成 份 編 號(hào) 十孔盒包裝
2×標(biāo)記專用 PCR Mix 90604a 500 uL(黃蓋)
含DIG-11-dUTP的dNTP，2mM 90604c 25 uL(綠色)
dNTP Mix，2 mM each 51208 50 uL(白蓋)
超純水 100935 1 mL(藍(lán)蓋)
使用手冊(cè) 90604sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 DNA 模板和模板專一性引物。

使用方法一：準(zhǔn)備工作

1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì) PCR 引物，使探針長(zhǎng)度在 400-800bp 之間。過短則 標(biāo)記參入少，探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱；過長(zhǎng)則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。

2. 由于標(biāo)記的 dNTP 比較珍貴，所以不推薦以基因組 DNA 或其他復(fù)雜 DNA 為模板直接進(jìn)行 PCR 標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來提高成功 率，即先制備非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物。 

3. 對(duì) A 型標(biāo)記試劑盒，四種 10mM 的 dNTP 是分開提供，用于制備 50uL 非標(biāo)記 dNTP（2mM each，用于非標(biāo)記 PCR，用于制備標(biāo)記 PCR 的模 板。配制方法是四種 10mM 的 dNTP 各加 10uL，再加水 10uL 即可） 和 25uL 標(biāo)記 dNTP（2mM each，其中標(biāo)記核苷酸和對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷 酸的比例需要自行優(yōu)化，假如是 biotin 或 DIG 標(biāo)記的是 dUTP，則其對(duì) 應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸是 dTTP，兩者的最佳比例一般為 1：3；如果是 BrdUTP，則兩者的最佳比例為 1：1。配制方法是三種 10mM 的 dNTP 各加 5uL，再加標(biāo)記核苷酸和其對(duì)應(yīng)的標(biāo)記核苷酸使其總的終濃度為 2mM，再補(bǔ)水到 25uL）。 

二：非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物的制備

4. 設(shè)置50uL非標(biāo)記PCR：2×標(biāo)記專用PCR Mix 25 uL，dNTP Mix（2mM each）5uL，自備的探針引物（10pmol/uL）各 1uL，1 ug 基因組 DNA 或 1ng 質(zhì)粒 DNA，補(bǔ)超純水到 50 uL。

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 參數(shù)進(jìn)行常規(guī) PCR。

6. 膠回 PCR 產(chǎn)物并定量，膠回收可以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記 PCR。

三：標(biāo)記 PCR 反應(yīng)（最好做一個(gè)不加標(biāo)記的對(duì)照用于定量）

注意：由于雙鏈 PCR 探針在雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會(huì)復(fù)性，降低雜交 效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記 PCR。

效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記 PCR。 成份 樣品 非標(biāo)記對(duì)照 2×標(biāo)記專用 PCR Mix 25 uL 25 uL A 型：含標(biāo)記核苷酸的 dNTP Mix B 型：含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP C 型：含 DIG-11-dUTP 的 dNTP 5 uL 不加 dNTP Mix，2mM 不加 5 uL 若單鏈標(biāo)記：加探針引物其一 50 pmol 50 pmol 若雙鏈標(biāo)記：加探針引物一和引物二 各 50 pmol 各 50 pmol 膠純化所得 PCR 產(chǎn)物（單鏈標(biāo)記可 用 100ng 模板） 10 ng 10 ng 超純水 補(bǔ)到 50 uL 補(bǔ)到 50 uL

注意：本試劑盒提供的 dNTP 混合物總濃度為 2mM，所含標(biāo)記 dUTP 與 非標(biāo)記 dTTP 的比例已經(jīng)進(jìn)過優(yōu)化。

7. 按第 5 步的 PCR 參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記 PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù) 增加到 35-55 個(gè)循環(huán)。由于模板為純化后的 PCR 產(chǎn)物，探針對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度 完整性要求不高（長(zhǎng)度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好）， 所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時(shí)間增加 15 秒，因?yàn)闃?biāo)記 dUTP 參入到 DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢；三是降低復(fù)性溫度 5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核 苷酸參入到 DNA 后，新模板的 Tm 值將降低。

8. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)液和對(duì)照反應(yīng)液 1-5 uL，在瓊脂糖凝膠上 跟濃度已知的 DNA marker 一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記產(chǎn) 物中額外帶有生物素，地高辛等、其泳動(dòng)速度將慢于非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物（但 同位素標(biāo)記不能用此法）。下圖是一個(gè)典型的雙鏈 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果圖： 標(biāo)記的 DNA（右）與未標(biāo)記的 DNA（左）電泳比較

注意：如果擴(kuò)增的是單鏈 DNA 探針，其結(jié)合 EB 的能力遠(yuǎn)低于雙鏈 DNA， 因此 EB 染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng) DNA 的真實(shí)濃度，可以采用銀染定量（跟 marker 比較）。一般 100ng 模板經(jīng)單鏈 PCR 擴(kuò)增可得到 700ng 左右探針。

9. 剩余的 PCR 標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加入（對(duì)單鏈 PCR 探針） 雜或加熱變性并急冷后加入（對(duì)雙鏈 PCR 探針）到雜交液中使用。也可 放-20℃長(zhǎng)期保存。如果需要純化，請(qǐng)使用乙酸銨/乙醇沉淀法純化。