一管式雙鏈cDNA合成試劑盒

產(chǎn)品及特點 本產(chǎn)品是用于一管式雙鏈 cDNA 合成的試劑盒。cDNA 一鏈合成的原理是以 Oligo dT 為通用引物的、MMLV 催化的逆轉(zhuǎn)錄反應。其原理如下：cDNA 第二鏈合成的原理是用 RNase H 使 RNA-DNA 雜合鏈中的 RNA產(chǎn)生切口，再用 DNA Polymerase I 通過切口平移(nick translation)反應進行 RNA 鏈取代合成 cDNA 第二鏈，其原理圖如下：

本產(chǎn)品具有下列特點：

1. 即開即用，含有合成兩條 cDNA 鏈的所有試劑。

2. 一管式進行，一鏈 cDNA 合成后不需要任何處理，直接進入第二鏈的合成。

3. 所得雙鏈 cDNA 可以直接用于后續(xù)的常規(guī) PCR、real-time PCR、cDNA 文庫構(gòu)建、抑制性差減雜交等。

4. 本試劑盒足夠 10 次 80uL 體系的雙鏈 cDNA 合成反應。
規(guī)格及成分 成份 編號 十孔盒包裝
Oligo dT 引物（0.5ug/uL） 100814 10 uL（白蓋）
cDNA 一鏈合成緩沖液 130308A 40 uL（紫色）
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 60905 10 uL（綠色）
5×cDNA 二鏈合成緩沖液 130308b 160 uL（紅色）
20×cDNA 二鏈合成酶混合液 130308c 40 uL（藍色）
0.2 M EDTA 溶液 130309 40 uL（黃色）
超純水 100935 1 mL（本色）
使用手冊 130308sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 mRNA 提取試劑盒

使用方法 一：mRNA 的制備

本試劑盒不提供 mRNA 提取試劑，用戶需自備相關(guān)試劑。

二：雙鏈 cDNA 的合成

1. 在一個干凈的塑料離心管中，按下表設(shè)置 cDNA 合成反應：

成分 用量

自備樣品 mRNA 4 uL（0.5-2ug）

Oligo dT 引物（0.5ug/uL） 1 uL

70℃ 2 分鐘后室溫放置 2 分鐘，短暫離心

cDNA 一鏈合成緩沖液 4 uL

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 uL

輕柔吹打混勻后 42℃保溫 90 分鐘合成一鏈 cDNA

超純水 48 uL

5×cDNA 二鏈合成緩沖液 16 uL

20×cDNA 二鏈合成酶混合液 4 uL

輕柔吹打混勻后，短暫離心，16℃保溫 2 小時

如果需要將雙鏈 cDNA 平末端化，則需加自備 T4 DNA 聚合酶

2 uL，輕柔吹打混勻后，16℃繼續(xù)保溫 30 分鐘。如果不需要將cDNA 平末端化，則直接進入下一步。0.2M EDTA 溶液 4 uL

2. 電泳 5uL 檢測 cDNA 質(zhì)量。如果 cDNA 在 0.5-10Kb 的范圍內(nèi)呈模糊一片，則 cDNA 合格。如果沒看見 cDNA 或有其他異常，需查找原因后再繼續(xù)。

3. 所得 cDNA 可以直接用于后續(xù)的常規(guī) PCR、real-time PCR、cDNA 文庫構(gòu)建、抑制性差減雜交等實驗。