釀酒酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品及特點(diǎn)Y187 菌株是 Clontech 公司開(kāi)發(fā)的 GAL4 系統(tǒng)酵母單雜，雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATα型， 可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蚺c MATa 型酵母菌株（Y2HGold，AH109 等）通過(guò) mating 操作進(jìn)行 篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker 為: trp1, leu2，報(bào)告基因?yàn)椋簂acZ, MEL1。Y187 -GAL4 酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：PGBKT7 和 PGADT7。質(zhì)粒 PGBKT7 的篩 選標(biāo)志為 TRP1，用于表達(dá) DNA-BD(來(lái)自酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸)與目 標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒 PGADT7 的篩選標(biāo)志為 LEU，用于表達(dá) AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4 系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母 轉(zhuǎn)錄因子 GAL4 可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于 N 端 1~174 位氨基酸區(qū)段的 DNA 結(jié)合域（DNA-BD）和位于 C 端 768~881 位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD 能夠識(shí)別 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并與之結(jié)合。而 AD 可以啟動(dòng) UAS 下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD 和 AD 單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn) 完整的 GAL4 活性，使含有 UAS 的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD 不與 AD 結(jié)合，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey 發(fā)生相互作用，就會(huì)促使 BD 和 AD 的相互 接近，形成完整的 GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 包裝
Y187 感受態(tài)細(xì)胞 140389A 0.1 mL×10
PGADT7（control vector），10 ng/μL 140389B 10 μL
Carrier DNA，5 μg/μL 140389C 100 μL
PEG/liAC 140389D 5 mL
使用手冊(cè) 1 份

運(yùn)輸及保存 感受態(tài)細(xì)胞干冰運(yùn)輸、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/liAC、PGADT7 質(zhì)粒 4℃保存；有效期半年。 

自備試劑 目的 DNA、YPDA、 SD 培養(yǎng)基等

使用方法

1. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100μL，可以根據(jù) 實(shí)際情況分裝使用。 以下實(shí)驗(yàn)以 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞為例。

2. 待感受態(tài)細(xì)胞融化后，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒 2-5μg，Carrier DNA（95-100℃ 5 分鐘，快速冰浴，重復(fù)一次）10μL，PEG/LiAc 500μL，吹打 混勻，30℃水浴 30 分鐘（15 分鐘時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻）。

3. 42℃水浴 15 分鐘（7.5 分鐘時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻）。

4. 5000 rpm 離心 40 秒，棄上清。取 400μL ddH2O 重懸沉淀，5000rpm 離心 30 秒，棄上清。

5. 取 50μL ddH2O 重懸沉淀，涂板，29℃培養(yǎng) 48-96 小時(shí)。

注意：

1. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比 YPDA 培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢， 以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培養(yǎng)可見(jiàn)直徑 1mm 克?。煌?SD 單缺平 板 29℃，48-60h 培養(yǎng)可見(jiàn)直徑 1mm 克隆，涂 SD 雙缺平板 29℃，60-80h 培養(yǎng)可 見(jiàn)直徑 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板 29℃，80-90h 培養(yǎng)可見(jiàn)直徑 1mm 克隆。

2. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平 板上的 Adenine 被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成 Adenine 以供利 用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破壞，Adenine 合成途徑受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物 P - ribosylamino imidazole（AIR） 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4. 同時(shí)轉(zhuǎn)化 2-3 種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

Y187 有兩個(gè)報(bào)告基因：lacZ, MEL1， 分別由兩種不同的啟動(dòng)子（G1，M1）啟動(dòng)，這兩種啟動(dòng)子只有 GAL4 識(shí)別的 17bp 核心 區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。 Y187感受態(tài)細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)室常用酵母雙雜用菌株，本產(chǎn)品經(jīng)特殊工藝制作而成，經(jīng) PGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率為104 cfu/μg DNA。

菌株基因型如下：

MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1