低pH緩沖液套裝

產(chǎn)品及特點非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE)是目前電泳法分離活性蛋白的 主要方法之一，跟 SDS-PAGE 根據(jù)分子量大小分離蛋白質(zhì)不同，它主要根 據(jù)蛋白質(zhì)的 pI 分離蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的 pI 各不相同，所以對不同靶蛋白 質(zhì)需要選用具有不同 pH 的電泳體系。單獨配制不同 pH 的 Native PAGE 電 泳膠十分繁瑣，為此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品。它有下列特點:

1. 即開即用，用戶不需單獨準備各種成分，十分方便。

2. 非變性，電泳過程中蛋白質(zhì)保持天然的構象和亞基之間的相互作用，得到 的蛋白質(zhì)一般都具有生物活性（而 SDS-PAGE 得到的蛋白沒有活性）。

3. 可以用于分析蛋白質(zhì)和 DNA 或 RNA 的相互作用、蛋白修飾、蛋白構型 改變、回收有活性蛋白質(zhì)等試驗。

4. 電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交等實驗。

5. 提供具有3種不同pH的緩沖液套裝，便于客戶選擇最適合的緩沖液體系。
規(guī)格及成分成 份 編 號 大紙盒包裝
丙烯酰胺干粉 100864 60 g（250mL 棕色塑料瓶）
甲叉雙丙烯酰胺干粉 100877 3 g
TEMED 100880 1.5 mL（棕色管）
過硫酸銨干粉 100879 1 g（本色蓋）
高中低緩沖液套裝選一 ABC 之一（見下）
使用手冊 81212sc 1 份
高 pH 緩沖液套裝（編號 100828，只有 81212A-30 有此成分）
高 pH 濃縮膠配膠液（pH 6.7），4× 100828a 100 mL
高 pH 分離膠配膠液（pH 8.9），4× 100828b 200 mL
高 pH 電泳液（pH 8.3） 100828c 10 L（干粉）
高 pH 上樣液，5× 100828d 1 mL
中 pH 緩沖液套裝（編號 100829，只有 81212B-30 有此成分）
中 pH 濃縮膠配膠液（pH 5.5），4× 100829a 100 mL
中 pH 分離膠配膠液（pH 7.5），4× 100829b 200 mL
中 pH 電泳液（pH 7.0）干粉 A 100829c 55.2g
中 pH 電泳液（pH 7.0）干粉 B 100829d 10g
中 pH 上樣液，5× 100829e 1 mL
低 pH 緩沖液套裝（編號 100830，只有 81212C-30 有此成分）
低 pH 濃縮膠配膠液（pH 6.7），4× 100830a 100 mL
低 pH 分離膠配膠液（pH 4.3），4× 100830b 200 mL
低 pH 電泳液（pH 4.5） 100830c 10 L（干粉）
低 pH 上樣液，5× 100830d 1 mL

運輸及保存 常溫運輸和保存，上樣液需低溫運輸、-20℃保存，保存期為一年。

自備試劑 去離子水、天然 PAGE 蛋白質(zhì)標準或蛋白質(zhì)等電電泳標準品

使用方法 特別說明：如何選擇緩沖液高、中低 pH 緩沖液套裝一定要配套使用。選擇適當 pH 的緩沖液（包括上樣液，電泳液，配膠液等）對蛋白質(zhì)非變性 PAGE 非常重要，此又跟靶蛋白質(zhì)的 pI 值密切相關。如果緩沖液的 pH 遠離靶蛋白的 pI，則蛋白質(zhì)分子帶電多（電荷密度大），電泳速度快，分辨率高。但過酸過堿又容易使蛋白質(zhì)結(jié)構變性，失去活性，所以最佳 pH 條件就是在電泳分辨率和維持活性之間尋找平衡，需要針對每種蛋白質(zhì)進行摸索或通過滴定曲線來確定，沒有通用的電泳緩沖體系。由于有近半數(shù)的蛋白質(zhì) pI 在 4-6.5，所以在不知道靶蛋白的 pI 時，可以先選用高 pH 緩沖系統(tǒng)。

一：配制分離膠

1. 確定濃度。對分子量在 100Kd 以上的蛋白質(zhì)，可選用 3-5%的膠；對分子量在 20-150KD 之間的蛋白質(zhì)，可選用 5-10%的膠；對分子量在10-80KD 之間的蛋白質(zhì)，可選用 10-15%的膠。對未知樣品，建議使用7.5%的膠。

2. 配制 10%的 APS（過硫酸銨）：按每 0.1 克過硫酸銨干粉加 1 mL 去離子水的比例配制 10%的 APS 溶液，該溶液可以在 4℃存放一周。

3. 配制 30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（19:1）溶液:在本產(chǎn)品提供的裝有60 克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入 146 mL 自備的去離子水和 3g 甲叉雙丙烯酰胺,充分搖晃直到溶解（約需 10-20 分鐘）即得 200 mL 30%丙烯酰胺（19:1）溶液。此溶液最好在一個月內(nèi)用完，必須 4℃避光保存。

4. 配 10 mL 分離膠(如果配制其他體積,請按比例調(diào)節(jié)各成分用量): 在一個25 mL 的三角瓶中，先加入 4.2 mL 去離子水、3.3 mL 30%丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺（19：1）溶液和2.5 mL 4×分離膠配膠液。

5. 搖晃混勻后抽真空 10-15 分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應，不去除的話將影響丙烯酰胺聚合反應）。

6. 加入 50uL 新配制的 10%APS 和 10uL TEMED（這是配制 10 mL 膠的用量，配制更大體積的膠則按比例增加），迅速搖勻后倒膠。注意：如果購買的是低 pH 緩沖系統(tǒng)，由于在低 pH 緩沖液中 PAGE 聚合速度降低，所以需要加倍上述兩成分的用量。

7. 在膠面距離頂部 1-1.5 cm 的時候停止灌膠。然后覆蓋一層 1-5 mm 厚的水，使膠頂部液面平整。由于比重不同，水和丙烯酰胺溶液不會混合。

8. 室溫聚合 30-60 分鐘后，用 1×分離膠配膠液洗滌凝固的膠的頂部，待用。

二：配制濃縮膠（濃縮膠可以提高分辨率，適合于成分復雜的樣品，一般使用濃度為 4%。使用濃縮膠時蛋白質(zhì)泳動速度主要跟其尺寸和形狀相關。因濃縮膠 pH 跟分離膠 pH 不同，蛋白質(zhì)可能會發(fā)生聚合和沉淀。對成分單一的樣品，可以不用濃縮膠，此時蛋白的泳動速度主要跟其電荷密度，尺寸和形狀相關。）

1. 配 10 mL 濃縮膠(如果配制其他體積,請按比例調(diào)節(jié)各成分用量): 在一個25 mL 的三角瓶中，先加入 6.2 mL 去離子水、1.3 mL 30%丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺（19：1）溶液和2.5mL 4×濃縮配膠液。

2. 搖晃混勻后抽真空 10-15 分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應，不去除將影響丙烯酰胺聚合反應）。

3. 按上表用量加入 50uL 10%APS 和 15uL TEMED（這是配制 10 mL 膠的用量，配制更大體積的膠則用量需按比例增加），迅速搖勻后在已經(jīng)凝固的分離膠上倒膠。

4. 在液面達到頂部時停止灌膠，插入梳子。

5. 室溫聚合 30-60 分鐘，拔出梳子，用 1×電泳液沖洗加樣孔。

三：電泳

1. 將凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽加入足夠 1×電泳液。注：本產(chǎn)品提供 10 升電泳液，對低和高 pH 電泳液，用前需將所有干粉溶解在1 L 水中得 10×電泳液，可以室溫放置，用時再稀釋成 1×電泳液。一般不需要再調(diào)節(jié) pH，但保險起見，可以用 pH 試紙測試一下 1×電泳液。低和高 pH 電泳緩沖液的 pH 分別是 4.5 和 8.3。對中 pH 電泳液，其干粉只能配 1×電泳液，否則不溶解。配制時稱取中 pH 電泳液（pH 7.0）干粉 A, 5.52g, 中 pH 電泳液（pH 7.0）干粉 B 1g 混勻，加去離子水至徹底溶解，調(diào) pH 到 7.0，定容至 1L?？蛻舾鶕?jù)可實際需要量按比例增減。

2. 連接電極。如果濃縮膠和分離膠的 pH 高于靶蛋白 pI，靶蛋白將帶負電荷并向陽極移動，可以按標準的 SDS-PAGE 方法接通電極（上陰極下陽極）；如果濃縮膠和分離膠pH低于靶蛋白pI，靶蛋白將帶正電荷并向陰級移動，此時應該下陰極上陽極。

3. 300V 預電泳直到電流不再降低（約需要 30 分鐘）以去除殘留過硫酸銨。

4. 換電泳液。

5. 在液體蛋白質(zhì)樣品中加入 5×上樣液（16 uL 液體樣品加 4uL 上樣液）后上樣。0.75 mm 厚的膠可以上 10 uL，1.5 mm 厚的膠可以上 20 uL。在未用加樣孔中也要加 1×上樣液以防有樣品的空道的樣品擴散。注意：如果用考染檢測，每個孔的蛋白最好在 50-100 ug 總蛋白，如果銀染則只需要 1ug 即可。樣品如果是蛋白質(zhì)沉淀，可用 1×上樣液直接溶解蛋白質(zhì)沉淀后再上樣。蛋白質(zhì)溶液或沉淀中不能含有能夠改變上樣液 pH 的殘留成分（如蛋白質(zhì)沉淀劑 TCA），用前最好用 pH 試紙測試一下，不在上樣液的 pH 范圍時就用酸或堿調(diào)到正常范圍。大量樣品可用透析法調(diào) pH。

6. 上樣自備的天然 PAGE 蛋白質(zhì)標準或等電電泳的標準品（如果有的話）。

7. 用 15 mA（對 0.75 mm 厚的膠）或 30 mM（對 1.5mm 厚的膠）的電流電泳直到染料移到分離膠底部。微型膠一般需要 1-2 小時。注意：電泳過程最好在冷室或有冷卻系統(tǒng)，以免電泳產(chǎn)熱使蛋白質(zhì)變性。

8. 終止電泳，取出凝膠進行后續(xù)的實驗處理（如染色或酶活性檢測）。