一站式Western印跡套裝–洗膜液

產(chǎn)品及特點Western Blot 是檢測固定在固相基質上的蛋白質的免疫方法，又叫免疫印跡 （immunoblotting）。該方法的是先將蛋白質從凝膠中轉移到固相基質（硝酸纖 維素膜）上；再對其進行特異性抗體檢測。由于涉及多種溶液，用戶單獨配制的 話十分繁瑣，為此天澤基因開發(fā)了本產(chǎn)品。它具有下列特點:

1. 一站式，提供除水、樣品和抗體以外的所有成分（檢測方法有 HRP 或 AP 檢測法兩種）。

2. 即開即用，用戶不需單獨準備各種成分，十分方便。

3. 靈敏，可檢測 10 pg 的蛋白質（HRP 或 AP 檢測法）。

4. 靈活，與 SDS-PAGE、非變性 PAGE 膠、等電聚焦電泳等兼容。 
規(guī)格及成分 成 份 編 號 A 型 B 型
濕法電轉液（100928-20） LM100928 20L（干粉） 20L（干粉）
硝酸纖維素膜
（10×10 cm）
100930 20 張 20 張
Western 封膜液（81210-100） LM81210 100 mL 100 mL
Western 洗膜液（81211-250） 81211 250 mL 250 mL
抗體稀釋液（81208）成分一 81208A 100 mL 100 mL
抗體稀釋液（81208）成分二 81208B 0.5 g 0.5 g
雜交袋（90206-20） 90206 20 個 20 個
HRP 顯色試劑之 TMB 溶液 A 10 mL 無
HRP 顯色試劑之 TMB 溶液 B 10 mL 無
AP 顯色試劑之 10×AP 緩沖液 無 50 mL
AP 顯色試劑之 BCIP 溶液 無 1 mL
AP 顯色試劑之 NBT 溶液 無 1 mL
Western 抗體清除劑（80813-200） 80813 200 mL 200 mL
使用手冊 81215sc 1 份 1 份

運輸及保存 常溫運輸和保存，顯色試劑需 4℃保存，有效期一年。

自備試劑 去離子水、濾紙、特異一抗、HRP 或 AP 標記的二抗。

使用方法

一：轉膜（濕法電轉移）

1. 制備濕法電轉液:將濕法電轉液干粉全部溶解在 1 L 去離子水中得 20×濕法電轉液，用時用去離子水稀釋 20 倍預冷待用。

2. 根據(jù) PAGE 膠的大小剪切同樣大小的濾紙和各邊都大 1 mm 的硝酸纖維素膜（以下簡稱膜）。避免手直接接觸膜。

3. 將切好的膜浸泡在新鮮稀釋的 1×濕法電轉液（下簡稱轉移液）中 15-20分鐘。注意：好用鑷子夾住膜的一邊輕輕置于轉移液上，只讓膜下層與轉移液接觸，通過毛細管作用使整個膜浸濕。避免讓膜沉入轉移液中，否則膜與轉移液之間形成的氣泡會阻止膜的濕潤。

4. 在容器中將兩塊海綿墊、六層濾紙用轉移液浸濕。

5. 在轉移夾上依次放上一張浸濕的海綿墊、三層浸濕的濾紙、一塊 PAGE 膠（只要分離膠部分）、一張浸濕的膜、三層浸濕的濾紙、一張浸濕的海綿墊。注意：每疊加層一定要用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。膜兩邊的濾紙對不能相互接觸，否則電轉移時會發(fā)生短路，燒壞裝置。

6. 合起轉移夾并放入轉移槽中（一定要注意方向，轉印帶負電荷的蛋白質時電極方向是膜正膠負；轉印帶正電荷的蛋白質時，電極方向是膜負膠正），然后用預冷的轉移液灌滿轉移槽。

7. 插上電極，一般在冷卻條件下用 100V 恒壓轉移 30-60 分鐘或冷室中 14V轉移過夜。

注意：一定要檢查電流的大小，電流一般在 0.1-0.4A。應根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉膜時間，對于小分子量的蛋白，轉膜時好墊 2 張或更多張膜（最多可 10 張），即使白質已經(jīng)轉過了一張膜，還會在其它膜上檢測到；對于大分子量的蛋白，轉膜時電壓要高一點，時間也要延長一點，開始好也用兩塊或多張膜。轉移時間長的時候特別要注意加強降溫措施如果目的蛋白轉移效率低，可以在轉移液中加終濃度為 20%的甲醇或

0.1%的 SDS。

8. 終止轉移后，取出膜，并在膜上剪去一個小角以標記方向。如有必要可用自備的各種染液對膠或膜進行染色以確定蛋白質轉移效率。

二：封膜

1. 將膜轉移至雜交袋中，加 5-10 mL Western 封膜液后熱密封雜交袋開口。提供的封膜液只適用于硝酸纖維素膜和 PVDF 膜，不用于尼龍膜。

2. 室溫下用脫色搖床搖動雜交袋 30-60 分鐘。

三：與一抗二抗結合

1. 用 5 mL Western 抗體稀釋液（配制方法：將抗體稀釋液成分二干粉到入成分一溶液中，溶解后即可。未用完的抗體稀釋液需-20℃保存）將自備的一抗稀釋至適當?shù)谋稊?shù)（一般需要稀釋 10-100000 倍使用，佳稀釋倍數(shù)跟一抗效價相關，需摸索）。

2. 剪開雜交袋的一角，倒去封膜液，加入 5 mL 新鮮稀釋的一抗溶液，加熱密封雜交袋開口。

3. 室溫下在脫色搖床上搖動雜交袋 30-60 分鐘。

4. 用抗體稀釋液將自備的 HRP 或 AP 標記的二抗稀釋至適當濃度（一般需要稀釋 500-4000 倍。佳稀釋倍數(shù)跟二抗效價相關，需摸索）。

5. 剪開雜交袋的一角，倒去一抗溶液（可留存），加入 5 mL 新鮮稀釋的二抗溶液，加熱密封雜交袋開口。

6. 室溫下在脫色搖床上搖動雜交袋 30-60 分鐘，也可過夜孵育。

7. 剪開雜交袋的一角，倒去二抗溶液（可留存）。

8. 剪開雜交袋，用鑷子取出膜，用 Western 洗膜液在器皿中洗 3 次，每次10 分鐘。

9. 根據(jù)二抗的標記酶選擇下面兩種顯色方法之一。

五：HRP 顯色檢測（對 HRP 標記的二抗，本產(chǎn)品 A 型）

1. 將膜平放，在吸附了抗原抗體的一面加入 100-500 uL TMB 溶液 A 和

100-500 uL TMB 溶液 B，鋪滿整個膜表面（具體用量可按膜的大小增減）。

2. 置于平式搖蕩儀上，在室溫下孵育 2 至 5 分鐘，直至深藍色條帶出現(xiàn)。

3. 用鑷子夾起膜，放入去離子水中洗膜 3 次終止反應，每次 30 分鐘。

4. 空氣中晾干后照相保存。注意：膜顯色后的顏色在數(shù)小時后將會褪色，不能存在，故需要及時照相。

六：AP 顯色檢測（對 AP 標記的二抗，本產(chǎn)品 B 型）

1. 用新鮮配制的 1×AP 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜 5 分鐘。

2. 將膜轉移到新配制的 BCIP-NBT 法 AP 顯色液中，每 cm2膜需要 0.1 mL顯色液。新鮮配制 BCIP-NBT 法 AP 顯色液（以 10 mL 為例）的方法：將9 mL 去離子水、1 mL 10×AP緩沖液、50 uL BCIP溶液和50 uL NBT溶液混勻。此溶液必須在 1 小時內(nèi)使用。

3. 室溫搖晃 5-30 分鐘顯色（37℃可加速反應）。

4. 顯色到合適程度后用自備去離子水洗膜 3 次終止反應，每次 30 分鐘。

5. 用吸水紙吸干膜上的水分，避光干燥保存或在一周內(nèi)照相。

七：Western 抗體清除劑（說明：此處理可能會使蛋白質失去某些表位）

1. 將膜浸泡在 Western 抗體清除劑中，70℃搖晃孵育 30 分鐘，去除一抗和二抗。用 Western 洗膜液洗膜兩次，每次 10 分鐘。

2. 膜即可用于下一次 Western 檢測的膜封堵步驟。