Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝 基苯基)-3-(4-硝 基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)。

CCK8的優(yōu)點(diǎn)：

方法方便，不用洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；

CCK-8快速檢測(cè)；

CCK-8檢測(cè)靈敏度高，細(xì)胞密度低也可以檢測(cè)；

CCK-8的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法；

CCK-8對(duì)細(xì)胞的毒性很??；

CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中是1瓶溶液，不需要現(xiàn)用現(xiàn)配，即開即用。

CCK8的缺點(diǎn)：

相比于與MTT法，CCK8的價(jià)格比較昂貴。

CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖/毒性的方法：

1.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。

2.根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)快慢決定鋪板細(xì)胞密度（多數(shù)為1000-2000 cell/well），每組3-5重復(fù)，每孔100-200μl培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)決定鋪板數(shù)量（如需要檢測(cè)5天，則鋪5張96孔板），我們以1000 cell/well，5復(fù)孔，200μl培養(yǎng)基，檢測(cè)5天為例，各實(shí)驗(yàn)組需要細(xì)胞數(shù)量為1000×5×5個(gè)細(xì)胞，從計(jì)數(shù)好的細(xì)胞懸液中取出所需的細(xì)胞量和完全培養(yǎng)基混勻，最終體積為200×5×5μl。 

3.統(tǒng)一鋪好后，待細(xì)胞完全沉淀下來后，在顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞密度，如果密度不均勻，則固定一組，微調(diào)其他組細(xì)胞的量再次鋪板（如：發(fā)現(xiàn)NC組細(xì)胞較多，降低細(xì)胞量再次鋪板），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.從鋪板后第二天開始，每孔加入10-20μl CCK-8溶液，如果每孔的培養(yǎng)基為100μl，則加入10μl CCK-8溶液，如果每孔的培養(yǎng)基為200μl，則加入20μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD 值的讀數(shù)）。用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。 

5.在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，對(duì)于大多數(shù)情況孵育2小時(shí)左右就可以了。 

6.用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度（使用酶標(biāo)儀之前要提前開啟10min預(yù)熱）測(cè)定完成后，保存數(shù)據(jù)。

7.連續(xù)五天檢測(cè)，每天保持一樣的時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育時(shí)間相同。

注：若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖/毒性的注意事項(xiàng)：

1.加入CCK8溶液時(shí)不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD 值的讀數(shù)；

2.要設(shè)計(jì)空白對(duì)照組；

3.對(duì)于大多數(shù)情況，加入CCK8溶液后，孵育2h左右就可以了；

4.使用酶標(biāo)儀之前要提前開啟10min預(yù)熱；

5.若連續(xù)多天檢測(cè)，必須保持所有條件一致。