小鼠神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白1(NRP1) ELISA Kit

檢測(cè)原理：

博爾森生物（BIOESN）生產(chǎn)的ELISA試劑盒采用抗體夾心法:將抗某蛋白抗體包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的某蛋白與抗體結(jié)合，加入生物素化的抗某蛋白抗體，再加入SABC復(fù)合物與生物素抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，然后加入TMB顯色底物，顯色劑顯藍(lán)色，最后加終止液變黃色，游離的成分被洗去。在450 nm處測(cè)OD值，某蛋白濃度與OD值之間呈正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出標(biāo)本中某蛋白的濃度。

試劑盒組分: （保存溫度4℃）

本試劑盒用于血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液及其它生物體液。

標(biāo)本收集與試劑準(zhǔn)備: 

1. 血清、血漿樣本收集應(yīng)使用一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝均可），血清、血漿避免使用溶血，高血脂標(biāo)本，標(biāo)本懸浮物應(yīng)離心去除，使標(biāo)本清澈透明。待測(cè)樣本應(yīng)盡早檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)；更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20℃或-80℃）保存，避免反復(fù)凍融。

2. 洗滌液配置：用蒸餾水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的蒸餾水）

3. 標(biāo)準(zhǔn)品配制：取7個(gè)1.5ml離心管，分別標(biāo)注1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64，blank。從第一至七管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液200ul。在第一管中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液200ul，置于漩渦混合器上混勻后用加樣器吸出200ul，移至第二管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋，從第六管中吸出200ul棄去，第七管為空白對(duì)照。

4. 

5. 生物素化抗體工作液配置:使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×工作液，根據(jù)所需用量配置，當(dāng)日使用，剩余棄之。

6. TMB顯色液的配置：使用前10分鐘，將TMB顯色液A液和B液1：1混合，避光放置備用。

7. 如果您檢測(cè)的樣本中靶蛋白濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，建議重新檢測(cè)，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。

檢測(cè)程序:

1. 加樣：空白孔加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液，其余孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50ul，將反應(yīng)板混勻后置37℃，40分鐘。

2. 洗板：用1×洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，每孔加入1×洗液350μl，每次震蕩/浸泡1-2分鐘，向?yàn)V紙上印干。

3. 空白孔加入100ul生物素化抗體稀釋液，其余孔各加入1×的生物素化抗體工作液100ul，混勻后置37℃，30分鐘。

4. 洗板：同上。

5. 每孔加入SABC復(fù)合物工作液100ul，混勻后置37℃，20分鐘。

6. 洗板：同上。

7. 每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul，混勻后置37 ℃暗處反應(yīng)10-20分鐘（具體顯色時(shí)間根據(jù)顯色結(jié)果而定）。

8. 每孔加入100ul終止液，混勻，30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

結(jié)果判斷與計(jì)算：

1. 所有OD值建議減除空白值后再行計(jì)算，如空白OD低于0.1，也可以直接計(jì)算。

2. 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，手工繪制或用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

試劑盒性能:

1、 檢測(cè)范圍:1.56-100ng/mL

2、 特異性:同時(shí)可檢測(cè)重組或天然的某種蛋白或抗體，不與其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

3、 重復(fù)性:板內(nèi)，板間變異系數(shù)均小于10%。

注意事項(xiàng)

1. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作雙孔檢測(cè)，每次檢測(cè)都應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 洗滌過(guò)程很關(guān)鍵，洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高，從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能 有結(jié)晶,屬于正?，F(xiàn)象，37℃水浴使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液。

3. 檢測(cè)時(shí)所有試劑都要恢復(fù)到室溫，板條開(kāi)封后剩余板條需封好，放回袋中2 個(gè)月內(nèi)用完。

4. 試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過(guò)深會(huì)出現(xiàn)絮狀物，屬正常現(xiàn)象，不影響結(jié)果判讀。

5. 僅用于科研，不能用于臨床診斷！