細(xì)胞核 蛋白和胞漿蛋白制備試劑盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit )    P1200

描述：用于從哺乳動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞中提取核 蛋白和/或胞漿蛋白，提取制備過(guò)程簡(jiǎn)便。制備的核 蛋白和胞漿蛋白能保持天然活性，并且純度高。提取的蛋白適于轉(zhuǎn)錄因子活性分析、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性測(cè)定，也適于Western Blot實(shí)驗(yàn)。

組份：

溫馨提示：

1.         操作應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，試劑需提前預(yù)冷。

2.         根據(jù)大致的細(xì)胞數(shù)，或大致估計(jì)離心后的細(xì)胞體積(Packed cell volume, PCV)來(lái)確定試劑的加入量。PCV因細(xì)胞類(lèi)型不同而有所差異。細(xì)胞數(shù)、PCV與試劑加入量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，參見(jiàn)下表：

操作步驟

1.         裂解：(1) 培養(yǎng)細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩次，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，或者估計(jì)離心后的細(xì)胞體積PCV。每1 ×10⁶個(gè)細(xì)胞加入50~100ml的CEB-A，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml離心管；或者每體積PCV細(xì)胞加入5倍PCV體積的CEB-A (即10~20 ml PCV的細(xì)胞加50~100ml的CEB-A)，劇烈振蕩重懸。

裂解: (2) 組織樣本，精確稱(chēng)重后剪成小塊，PBS洗滌。通常每10 mg動(dòng)物組織相當(dāng)于1×10⁶個(gè)細(xì)胞，需加入50~100ml CEB-A，參照上表按比例加入。在冰上使用玻璃勻漿器勻漿組織，通常需要20~40次上下抽動(dòng)勻漿，棄去筋膜組織。切記勿用高速電動(dòng)勻漿器或超聲破碎組織避免破壞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。

2.         裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml離心管，劇烈振蕩30秒，冰浴10~15min，期間每5分鐘振蕩15秒。

3.         可選步驟：根據(jù)步驟2裂解物體積，加入1/20體積的CEB-B，振蕩10秒，冰浴1min (加入CEB-B可去除部分核膜蛋白，適于制備高純度的核 蛋白用于EMSA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)等，但可使胞漿蛋白出現(xiàn)很少量的膜蛋白污染。若制備高純度胞漿蛋白可跳過(guò)此步驟。若制備核 蛋白僅用于普通的Western Blot目的，則無(wú)須高純度核 蛋白，也可省略此步驟。

4.         胞漿蛋白組分的制備：將步驟2或步驟3的上清，12000g 4 ^oC離心5min，勿觸動(dòng)沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到新管，此即胞漿蛋白組分，可立即使用或?20~?70oC保存。

5.         胞核粗提組分的制備：取第步驟4的原離心管，12000g 4 ^oC瞬時(shí)離心，盡量吸除上清，保留沉淀。加入100μl CEB-A和5 ml CEB-B，振蕩10秒，重懸沉淀，冰浴1min，1000g 5min，棄上清。再次加入100μl CEB-A和5 ml CEB-B重懸沉淀冰浴1min，1000g 5min，盡棄上清，保留沉淀。

6.         胞核 蛋白的制備：加50~100μl預(yù)冷NEB重懸步驟5的離心沉淀，劇烈振蕩15秒，冰上30min，期間每10 min振蕩15秒。12000g 5min，上清液含核 蛋白成分，其中含有25%的甘油；可立即使用或?20~?70oC保存。

說(shuō)明：1. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，每10⁶個(gè)細(xì)胞大約得到50-75μg蛋白。2. 裂解時(shí)間是重要的，過(guò)短則細(xì)胞裂解不全導(dǎo)致蛋白產(chǎn)率低，裂解時(shí)間長(zhǎng)則導(dǎo)致胞漿蛋白有核 蛋白污染。3.只需對(duì)提取的胞漿蛋白定量(Braford或BCA法)，核 蛋白純度高但含量低，無(wú)需定量，對(duì)于同一個(gè)制備，核 蛋白與胞漿蛋白的量于相平行。4. 上述制備的蛋白樣品與2x SDS-PAGE混合即可上樣電泳。5. 切記采用手動(dòng)玻璃勻漿器，勿用高速電動(dòng)勻漿器或超聲破碎組織細(xì)胞，避免破壞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分離的組分污染。玻璃勻漿器須配套選用間隙嚴(yán)緊的研杵，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，提起研杵而套管不會(huì)脫落。正確勻漿是先下壓旋轉(zhuǎn)研杵擠破組織，然后上下緩慢推拉研杵破碎細(xì)胞。組織樣品制備效果不如細(xì)胞樣品。