線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1） C0008

描述：研究表明線粒體與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體跨膜電位（△ψ）的破壞，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA 斷裂） 出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

試劑盒采用 JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)一種陽離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1 有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時(shí)以單體形式存在，高濃度時(shí)以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，但均可在流式細(xì)胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光，JC-1 可透過正常細(xì)胞 膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（△ψ）具有極性，JC-1 依賴于△ψ的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體發(fā)射光為紅色熒光；可被流式細(xì)胞儀的紅色（FL-2）通道檢測到，而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1 從線粒體內(nèi)釋放，紅光強(qiáng)度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。

適用范圍：可應(yīng)用于細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測

規(guī)格及儲存： JC-1        50μL     -20℃ 避光保存  一年有效

10×Incubation Buffer     10ml   4℃保存  一年有效

需要用到的儀器和其他試劑：流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、高速離心機(jī)、CO2 培養(yǎng)箱、微量移液器

1.5ml Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、滅菌去離子水

操作步驟：

1.         用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，設(shè)立陰性對照組和陽性對照組【用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑（如星形孢菌素，staurosporine），誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后經(jīng)其它檢測（如 AnnexinV 或Caspase3 活性）證實(shí)確有凋亡產(chǎn)生】，收集細(xì)胞；

2.         JC-1 工作液的配置：取 2μL JC-1（500×），加入 900μL 滅菌去離子水中，劇烈渦旋充分溶解并混勻 JC-1。加入 100μL 10×Incubation Buffer，混勻后即為 1 mL JC-1 工作液。

注：細(xì)胞懸液每 50-100 萬細(xì)胞大概需 500 μL JC-1 工作液。六孔板每孔需要 1mL 的 JC-1 工作液，

其它培養(yǎng)器皿的 JC-1 工作液的用量以此類推；

3.         1×Incubation Buffer  的配置：取 100μL 10×Incubation Buffer 加 900μL 滅菌去離子水稀釋成 1

×Incubation Buffer，混勻并預(yù)熱至 37℃?zhèn)溆茫?懸浮細(xì)胞

1.   取 1×10⁵ ~10⁶ 細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞二次（離心 2000rpm5min）；

2.   取 500μL JC-1 工作液將細(xì)胞均勻懸浮，37℃，5%CO² 的培養(yǎng)箱中孵育 15~20min；

3.   室溫離心（2000rpm，5min）收集細(xì)胞，用 1×Incubation Buffer 洗兩次：加入 1mL 1× Incubation Buffer 重懸細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，再次加入 1mL 1×Incubation Buffer 重懸細(xì)胞，離心收集細(xì)胞；

4.   吸取 500μL 1×Incubation Buffer 重新懸浮細(xì)胞；5. 熒光顯微鏡觀察、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀分析。

貼壁細(xì)胞

（希望采用熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，建議先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法）

1.   對于六孔板，吸除培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌細(xì)胞一次；

2.   加入 1mL JC-1 工作液，將細(xì)胞均勻覆蓋，37℃，5%CO² 的培養(yǎng)箱中孵育 15~20min；

3.   吸除上清，用 1×Incubation Buffer 洗兩次；

4.   加入 1-2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液(可含血清和酚紅)；

5.   熒光顯微鏡觀察或激光共聚焦拍照分析。純化的線粒體

1.   把配置好的 JC-1 工作液用 1×Incubation Buffer 稀釋 5 倍；

2.   向 900μL 稀釋后的 JC-1 工作液中加入 100μL 總蛋白量為 10-100 ug 的純化的線粒體，37℃，

5%CO² 的培養(yǎng)箱中孵育 10~20min；

3.   熒光顯微鏡觀察、激光共聚焦拍照或熒光酶標(biāo)儀分析。

A.   熒光顯微鏡觀察

檢測 JC-1 單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm，發(fā)射光設(shè)置為 530nm；檢測 JC-1 聚合物時(shí)， 可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm，發(fā)射光設(shè)置為 590nm。

注意：此處測定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1 單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如GFP 或 FITC 時(shí)的設(shè)置；檢測 JC-1 聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

正常細(xì)胞：雙色濾光片觀察則為：綠++ 紅++（高綠高紅），在同一濾光片下觀察則為黃綠色凋亡細(xì)胞：雙色濾光片觀察則為：綠++ 紅+（高綠低紅）， 如在同一濾光片下觀察則為綠色

B.   流式細(xì)胞儀分析

用流式細(xì)胞儀檢測（Ex=488 nm; Em=530 nm）細(xì)胞凋亡的情況，綠色熒光通過 FITC 通道通常為 FL1 來檢測；紅色熒光通過PI 通道通常為 FL2 來檢測。

正常細(xì)胞{FL-1 亮,FL-2 亮; R1}，凋亡細(xì)胞 {FL-1 亮, FL-2 暗; R2}，設(shè)門的位置根椐細(xì)胞種