活性氧檢測(cè)試劑盒   (Reactive Oxygen Species Assay Kit)  C1300

 

描述：活性氧包括超氧自由基（O₂?^?）、過(guò)氧化氫（H₂O₂）、羥基自由基（?OH）、過(guò)氧亞硝基（ONOO^?）、一氧化氮（?NO）等，它們參與了細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、發(fā)育分化、衰老和凋亡等許多生理和病理過(guò)程。   試劑盒采用DCFH-DA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)探針?lè)椒?，是迄今最常用、最靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)探針。DCFH-DA沒(méi)有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可以被酯酶水解為不能透過(guò)細(xì)胞 膜的DCFH（dichlorofluorescin），當(dāng)活性氧存在時(shí)，DCFH被氧化為強(qiáng)綠色熒光物質(zhì)DCF（dichlorofluorescein），熒光在激發(fā)波長(zhǎng)502 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm附近有最大波峰，熒光水平與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。本試劑盒提供的活性氧檢測(cè)系統(tǒng)本底水平低，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。

適用范圍：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、新鮮動(dòng)物組織

工作波長(zhǎng)：最佳激發(fā)波長(zhǎng)500（500 ± 15 nm），最佳發(fā)射波長(zhǎng)525 (530 ± 20 nm)。也可按照FITC熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。

組成： (1)  0.1 ml, 10 mM DCFH-DA，-20 oC避光保存  一年有效

(2)  1 ml活性氧供體，-20oC避光保存  一年有效

所需設(shè)備：流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)等

操作步驟：

一、細(xì)胞樣本：

1.         收集細(xì)胞，進(jìn)行活性氧測(cè)定

1.1 細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞：2000rpm，離心5min，收集沉淀，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細(xì)胞沉淀；貼壁細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液反復(fù)吹打，使細(xì)胞層全部進(jìn)入PBS或培養(yǎng)液中，收集細(xì)胞懸液，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細(xì)胞沉淀；

1.2加入DCFH-DA探針，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照管

樣本管：用稀釋好的DCFH-DA熒光探針重懸細(xì)胞沉淀，一般情況下，細(xì)胞密度要求1*10⁶-2*10⁷/ml，推薦探針初始工作濃度為10 μM（DCFH-DA工作濃度可在100 nM~20 μM范圍內(nèi)，這需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適濃度）。

陰性對(duì)照：不加探針，只加入PBS或培養(yǎng)基的細(xì)胞。

陽(yáng)性對(duì)照：已加入DCFH-DA熒光探針，并加入活性氧供體的細(xì)胞懸液，推薦試劑工作濃度20-100 μM。

1.3 37 oC孵育細(xì)胞30分鐘~幾個(gè)小時(shí)。通常情況下，30-60分鐘即可。注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度等有關(guān)。可以每隔5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

1.4 1000g，離心5min，去上清收集細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞。

1.5 進(jìn)行熒光檢測(cè)，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

 

2. 不收集細(xì)胞，直接將探針加入培養(yǎng)基測(cè)定

2.1加入DCFH-DA探針，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照管

樣本管：去除細(xì)胞培養(yǎng)基上清，加入用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋好的DCFH-DA探針（推薦探針終濃度為10 μM），加入探針的體積以能蓋住細(xì)胞為宜，通常6孔板單孔不少于1ml。

陰性對(duì)照：不加探針，只加入培養(yǎng)基的細(xì)胞。

陽(yáng)性對(duì)照：已加入DCFH-DA熒光探針，并加入活性氧供體的細(xì)胞，推薦試劑工作濃度20-100 μM。

2.2 37 oC孵育細(xì)胞30分鐘~幾個(gè)小時(shí)。通常情況下，30-60分鐘即可。注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度等有關(guān)?？梢悦扛?/span>5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

2.3 棄去上層培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)液或0.01M PBS反復(fù)吹打，使細(xì)胞層全部進(jìn)入PBS或培養(yǎng)液中。

2.4收集細(xì)胞懸液，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，1000rpm，離心5min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞。

2.5進(jìn)行熒光檢測(cè)，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

 

二、 動(dòng)物組織樣本

1.1細(xì)胞懸液制備：可采用單細(xì)胞懸液制備儀或傳統(tǒng)的組織處理方法如：酶解法、研磨法等制備單細(xì)胞懸液；

1.2加入DCFH-DA探針，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照管

樣本管：用稀釋好的DCFH-DA熒光探針重懸細(xì)胞沉淀，一般情況下，細(xì)胞密度要求1*10⁶-2*10⁷/ml，推薦探針初始工作濃度為10 μM（DCFH-DA工作濃度可在100 nM~20 μM范圍內(nèi)，這需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適濃度）。

陰性對(duì)照：不加探針，只用0.01M PBS重懸的細(xì)胞。

陽(yáng)性對(duì)照： 已加入DCFH-DA熒光探針，并加入活性氧供體的細(xì)胞懸液，推薦試劑工作濃度20-100 μM。

1.3 37 oC孵育細(xì)胞30分鐘~幾個(gè)小時(shí)。通常情況下，30-60分鐘即可。注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度等有關(guān)。可以每隔5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

1.4 1000g，離心5min，去上清收集細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞

1.5 進(jìn)行熒光檢測(cè)，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

 

注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒特別適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞活性氧的檢測(cè)。對(duì)于動(dòng)物組織樣本而言，應(yīng)盡量選擇新鮮組織，勻漿操作應(yīng)盡量快速，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，如果樣本已經(jīng)凍存，則無(wú)法保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2. DCFH-DA可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。血清或培養(yǎng)基的顏色并不會(huì)影響DCFH-DA及細(xì)胞內(nèi)熒光的產(chǎn)生，但可能會(huì)影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀的熒光測(cè)定。如果用上述儀器進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可將DCFH-DA稀釋于無(wú)酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如PBS中。

3. 加入DCFH-DA的時(shí)機(jī)和孵育時(shí)間，以最終能順利檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧為目的。當(dāng)細(xì)胞藥物處理時(shí)間較短(如<2 小時(shí))或預(yù)計(jì)ROS效應(yīng)較弱時(shí)，可將DCFH-DA在藥物處理之前或者與藥物同時(shí)加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中；反之，當(dāng)藥物處理時(shí)間較長(zhǎng)(如>6小時(shí))或預(yù)計(jì)產(chǎn)生ROS效應(yīng)較強(qiáng)時(shí)，可將DCFH-DA在藥物處理之后再加入。

4. 活性氧供體內(nèi)含高純度12 mM 的H₂O₂。加入細(xì)胞后可使DCFH-DA氧化為DCF呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光。推薦該試劑的細(xì)胞工作濃度為20-100 μM或更低濃度，當(dāng)其濃度超過(guò)200μM時(shí)，將產(chǎn)生細(xì)胞毒性。如果用戶熟悉ROS熒光或?qū)嶒?yàn)沒(méi)有必要采用陽(yáng)性對(duì)照，可以不加該試劑。一般情況下，活性氧供體加入到細(xì)胞30min左右即可產(chǎn)生明顯的綠色熒光。

 

 

以下僅僅列舉部分使用北京普利萊基因技術(shù)公司活性氧檢測(cè)試劑盒發(fā)表的SCI研究論文：

1. Liu Xin, Sun Jiao, 2010. Endothelial cells dysfunction induced by silica nanoparticles through oxidative stress via JNK/P53 and NF-κB pathways. Biomaterials, 31(32): 8198-8209. 

 

2. Yuan Shaopeng, Fu Yan, Wang Xiaofeng, Shi Hubing, Huang Yujie, Song Xiaomin, Li Ling, Song Nan, Luo Yongzhang, 2008. Voltage-dependent anion channel 1 is involved in endostatin-induced endothelial cell apoptosis. The FASEB Journal, 22: 2809-2820.    

 

3. Deng Sanming, Yang Ye, Han Yong, Li Xiaofei, Wang Xiaoping, Li Xueyong, Zhang Zhipei, Wang Yunjie, 2012. UCP2 Inhibits ROS-Mediated Apoptosis in A549 under Hypoxic Conditions. PLoS ONE, 7(1): e30714. doi:10.1371/journal.pone.0030714. 

 

4. Zhuo Wei, Song Xiaomin, Zhou Hao, Luo Yongzhang, 2011. Arginine deiminase modulates endothelial tip cells via excessive synthesis of reactive oxygen species. Biochemical Society Transactions, 39: 1376-1381.     

 

5. Yue Yang, Zhou Huafeng, Liu Guanlan, Li Yan, Yan Zemin, Duan Mingxing, 2010. The advantages of a novel CoQ10 delivery system in skin photo-protection. International Journal of Pharmaceutics, 392(1-2): 57-63. 

 

6．Zhong Z-M, Bai L, Chen J-T, 2009. Advanced Oxidation Protein Products Inhibit Proliferation and Differentiation of Rat Osteoblast-like Cells via NF-κB Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry, 24(1-2): 105-114.  

 

7． Chen Guozhu, Zhang Xuhui, Zhao Ming, Wang Yan, Cheng Xiang, Wang Di, Xu Yuanji, Du Zhiyan, Yu Xiaodan, 2011. Celastrol targets mitochondrial respiratory chain complex I to induce reactive oxygen species-dependent cytotoxicity in tumor cells. BMC Cancer, 11:170. doi:10.1186/1471-2407-11-170.  

 

8．Zhao Hong, Liu GuoLiang, Wang QiuYue, Ding LiYing, Cai Hui, Jiang HaiHong, Xin ZhongQiu, 2007. Effect of ghreli n on human endothelial cells apoptosis induced by high glucose. Biochemical and Biophysical Research Communications, 362(3): 677-681.