組織細(xì)胞甘油酶法測(cè)定試劑盒    E1012

 

描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo)，但檢測(cè)更加方便。本試劑盒采用優(yōu)化步驟，能夠檢測(cè)實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油含量，線性范圍為10-1200μmol/L。

 

原理：在ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫；在過(guò)氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

 

適用范圍：測(cè)定實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油濃度。

 

組成 (105次微板測(cè)定或30次1 ml比色杯測(cè)定)：

(1)    裂解液 50 ml   

(2)    R1試劑 16 ml

(3)    R2試劑  4 ml    

(4)    4 mmol/L甘油標(biāo)準(zhǔn)品1 ml

4 oC保存  6個(gè)月有效

 

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或721、722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)。最佳工作波長(zhǎng)550nm，如無(wú)此波長(zhǎng)建議優(yōu)先選用570nm、次選530、490nm。

 

一 組織細(xì)胞裂解

細(xì)胞(包括分化的脂肪細(xì)胞)裂解：

消化、離心收集細(xì)胞?；蛑苯釉谂囵B(yǎng)皿內(nèi)裂解。通常6孔板單孔約2x10⁶個(gè)細(xì)胞，75cm²瓶約1x10⁷細(xì)胞。按比例每1~2 x 10⁶細(xì)胞加0.1ml裂解液，震蕩或渦旋裂解后，靜置10分鐘。

 

動(dòng)物組織裂解：

切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進(jìn)行保存。組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切、稱重可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的測(cè)量誤差。離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計(jì)算組織重量(約100mg)。強(qiáng)烈建議按比例每1mg組織加10μl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。（注意；裂解液用量在1ml或更多可保證有效的裂解與脂質(zhì)提取）。用電動(dòng)高速勻漿器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。（不推薦超聲方法，因其不能完全和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量），而后，靜置10分鐘。

 

二. 裂解液處理：

1.    取適量上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，進(jìn)行步驟2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量試劑盒(#P1511)進(jìn)行蛋白定量或－20oC儲(chǔ)存。

2.    70oC 加熱10分鐘滅活脂肪酶，可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

3.    室溫5000rpm離心5分鐘，上層清液即可用于酶學(xué)測(cè)定。

 

三 工作溶液配制：按4:1比例，取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混合即可，立即使用或4oC保存<1天，變色棄去。（注意：謹(jǐn)防來(lái)源不明但容易發(fā)生的甘油污染，可來(lái)自操作者本人或標(biāo)準(zhǔn)品液體微粒濺射等。）

 

四 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將4 mM甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μmol/L，通常取其中4~6管即可，注意設(shè)置0濃度對(duì)照反應(yīng)管。

 

五 甘油測(cè)定

1.    參見(jiàn)下表加樣。待測(cè)樣品體積10μl，多加可能會(huì)抑制反應(yīng)。

2.    37oC或25oC反應(yīng) 10分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

3.    先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各管OD值。

4.    繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度。

附Excel作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)?，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R²值-。

5.    以每mg蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正甘油含量。

加樣表（可對(duì)樣品和工作液比例進(jìn)行微量調(diào)整）

 

說(shuō)明：

1. 維生 素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測(cè)試。

2. 紅細(xì)胞糖酵解時(shí)合成磷酸甘油影響測(cè)定。

 

參考文獻(xiàn)：

1.  Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

2.  Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 1