液體樣本游離膽固醇酶法測(cè)定試劑盒   E1006

描述：血漿總膽固醇包括2/3的膽固醇酯和1/3的游離膽固醇，是血脂的重要組分，二者與心腦血管疾病以及多種病理狀態(tài)密切相關(guān)。本試劑盒采用世界衛(wèi)生組織(WHO)、美國(guó)FDA、中國(guó)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》推薦的總膽固醇和游離膽固醇檢測(cè)方法，靈敏度高，檢測(cè)范圍20~5000 μmol/L?？煽啃院椭貜?fù)性俱佳。

原理：本試劑盒測(cè)定方法采用CHOD-PAP終點(diǎn)方法結(jié)合經(jīng)典GPO Trinder酶學(xué)反應(yīng)^【1】,其原理為：(1) 膽固醇酯酶分解膽固醇酯為游離膽固醇。(2) 膽固醇氧化酶將游離膽固醇氧化，產(chǎn)生過(guò)氧化氫。(3) 在過(guò)氧化物酶催化下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，光密度值與膽固醇濃度成正比。

測(cè)定樣本范圍： 血清、培養(yǎng)基

組成：(1) R1試劑   40 ml     (2) R2試劑   10 ml      (3) 5 mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品   0.5 ml

儲(chǔ)存條件：4oC保存 6個(gè)月有效

所需設(shè)備：721、722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、生化分析儀。最佳工作波長(zhǎng)550-555nm，如儀器無(wú)此波長(zhǎng)建議優(yōu)先選用570 nm，次選530、490nm。常規(guī)比色杯即可。

操作步驟：

一、工作溶液配制: 按4:1比例，取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混合即可，立即使用或4oC保存<1天，變色棄去。

二、樣本處理：

培養(yǎng)基：取無(wú)酚紅無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液，4oC，10,000g離心5 min，取上清測(cè)定。新鮮培養(yǎng)基4oC存放不宜超過(guò)1小時(shí)，若暫時(shí)無(wú)法測(cè)定可70oC加熱10 min后凍存，測(cè)定前離心。

血液：新鮮血液4oC， 2000 g離心5 min得到血漿，非抗凝血4oC放置2小時(shí)得到血清。可4oC 存放數(shù)天或?20 oC半年。如超過(guò)線性范圍用生理鹽水1:1~1:5稀釋后測(cè)定。

三、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?zhuān)?/span>

5 mM膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)水乙醇倍比稀釋為2500、1250、625、312.5、156、78、39 μmol/L。通常稀釋4個(gè)點(diǎn)/管即可，注意設(shè)置0濃度對(duì)照反應(yīng)管。立即使用。

四、游離膽固醇測(cè)定：

1. 取180 μl（180~190μl）測(cè)定工作溶液。

2. 在各工作液中，分別加入20 μl (10~20μl) 空白對(duì)照溶液（無(wú)水乙醇或蒸餾水均可）、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品，反應(yīng)總體積200 μl。

3. 37oC 反應(yīng)20min也可25oC室溫反應(yīng)30 min但靈敏度會(huì)略微降低。反應(yīng)平衡后顏色在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

4. 測(cè)定時(shí)，先用蒸餾水或無(wú)水乙醇空白對(duì)照管調(diào)零，然后測(cè)定各管OD值。

5. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算游離膽固醇濃度。

Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)?，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R²值-。

總膽固醇測(cè)定：請(qǐng)參見(jiàn)液體樣本總膽固酶法測(cè)定試劑盒貨號(hào)E1005、組織細(xì)胞總膽固醇酶法測(cè)定試劑盒貨號(hào)E1015說(shuō)明書(shū)。

膽固醇酯測(cè)定：在測(cè)定膽固醇酯含量時(shí)，需要同時(shí)采用以上E1005和E1006兩種試劑盒，分別測(cè)定總膽固醇和游離膽固醇，二者的差值即為膽固醇酯的含量。適于血液和某些細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯測(cè)定。

膽固醇酯在肝臟生成。血膽固醇酯降低和膽固醇酯/總膽固醇酯比值降低見(jiàn)于慢性肝病。膽道阻塞時(shí)，血膽固醇酯與總膽固醇濃度均升高但其比值正常。故有助于肝實(shí)質(zhì)損害與單純膽道阻塞的鑒別診斷。

需要注意的是：這種由差值計(jì)算求得的膽固醇酯的值，主要適合血液樣品測(cè)定，可能不很適合培養(yǎng)基、細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯測(cè)定。其原因主要與細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯和游離膽固醇的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、外流、儲(chǔ)存、分解、再酯化等諸多動(dòng)態(tài)生物過(guò)程的非線性的高度復(fù)雜性有關(guān)，還與現(xiàn)有測(cè)量方法的局限性有關(guān)。另外，膽固醇(酯)的含量以及代謝方式在不同類(lèi)型的細(xì)胞內(nèi)如肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等存在巨大差異。有時(shí)以差值計(jì)算的膽固醇酯出現(xiàn)背離和偏差，甚至為負(fù)值。如果出現(xiàn)這種情況，建議在數(shù)據(jù)分析時(shí)采用膽固醇酯/總膽固醇比值，而非膽固醇酯絕對(duì)值；或者嘗試用同位素標(biāo)記方法、薄層層析、HPLC等方法測(cè)定膽固醇酯，或許會(huì)有改善。

說(shuō)明：

1.    可微量調(diào)整樣品與工作液體積比例。

2.    正常人血中總膽固醇參考值2.86~5.98mmol/L或 110~230mg/dl。

3.  維生 素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、強(qiáng)還原劑二硫蘇糖醇、巰基乙醇等干擾測(cè)試。

以下僅僅列舉部分使用普利萊游離膽固醇測(cè)定試劑盒發(fā)表的SCI文章，供參考。

1、Yao S, Zong C, Zhang Y, et al. Activating transcription factor 6 mediates oxidized LDL-induced cholesterol accumulation and apoptosis in macrophages by up-regulating CHOP expression[J]. Journal of atherosclerosis and thrombosis, 2013, 20(1): 94-107.

2、Zou J, Xu L, Ju Y, et al. Cholesterol depletion induces ANTXR2-dependent activation of MMP-2 via ERK1/2 phosphorylation in neuroglioma U251 cell[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2014, 452(1): 186-190.

3、Li H, Li H, Guo H, et al. Cholesterol suppresses adipocytic differentiation of mouse adipose-derived stromal cells via PPARγ2 signaling[J]. Steroids, 2013, 78(5): 454-461.

4、Tong L T, Zhong K, Liu L, et al. Effects of dietary hull-less barley β-glucan on the cholesterol metabolism of hypercholesterolemic hamsters[J]. Food chemistry, 2015, 169: 344-349.

5、Li H, Guo H, Li H. Cholesterol loading affects osteoblastic differentiation in mouse mesenchymal stem cells[J]. Steroids, 2013, 78(4): 426-433.

6、Wu D M, He Z, Ma L P, et al. Increased DNA methylation of scavenger receptor class B type I contributes to inhibitory effects of prenatal caffeine ingestion on cholesterol uptake and steroidogenesis in fetal adrenals[J]. Toxicology and applied pharmacology, 2015, 285(2): 89-97.

7、Zhu T, Ai Q, Mai K, et al. Feed intake, growth performance and cholesterol metabolism in juvenile turbot (Scophthalmus maximus L.) fed defatted fish meal diets with graded levels of cholesterol[J]. Aquaculture, 2014, 428: 290-296.

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9、Zhao X, Gao M, He J, et al. Perilipin1 Deficiency in Whole Body or Bone Marrow-Derived Cells Attenuates Lesions in Atherosclerosis-Prone Mice[J]. PloS one, 2015, 10(4).

10、Wu Q, Li J, Zhao T, et al. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase in the presence of glycerol[J]. Pakistan journal of pharmaceutical sciences, 2014, 27(6): 1905-1910.