普利萊 人血管內(nèi)皮生長因子受體2 ELISA試劑盒   AZ0173   (Human VEGF R2/KDR ELISA Kit)

原理：本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗大鼠抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，經(jīng)過孵育，樣本中存在的抗原與固相抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入生物素化的檢測抗體孵育。洗滌去除未結(jié)合的生物素化的抗體，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素 (Streptavidin HRP) 。洗滌后，加入信號增強(qiáng)劑孵育，洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，再次加入 Streptavidin HRP 。洗滌后，加入顯色底物TMB，避光顯色。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中TNFα的濃度成正比。加入終止液終止反應(yīng)，在450nm波長（參考波長570 -630 nm）測定吸光度值。

組成：試劑盒保存于2-8℃，有效期標(biāo)注于標(biāo)簽上。只有恰當(dāng)保存的試劑才是有保證的。如果試劑盒的組分需要再次使用，請確保上一次使用之后沒有被污染。

檢測步驟

1. 樣本采集與貯存

細(xì)胞培養(yǎng)上清

300 ×g離心10分鐘去除沉淀物，即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。

血清樣本

離心管收集血清。血樣凝集30分鐘后，1,000 ×g離心10分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。

血漿樣本

EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。1,000 ×g離心30分鐘收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。

本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清和血漿已經(jīng)過驗證。

注意：檢測前，樣本中可見的沉淀必須去除。不要使用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。樣本應(yīng)分裝并貯存于-20℃，以避免IGF-1活性的丟失。如果在24小時內(nèi)檢測。樣本可以存放在2 -8℃。避免樣本的反復(fù)凍融。在檢測前，冷凍樣本應(yīng)緩慢地恢復(fù)至室溫，輕柔地混勻。

2. 樣本準(zhǔn)備

正常小鼠血清血漿樣本需要1000倍稀釋。推薦兩步稀釋。第一步，10 μl樣本+ 190 μl 1×檢測緩沖液。第二步，10 μl第一步稀釋的混合樣本+ 490 μl 1×檢測緩沖液。

正常大鼠血清血漿樣本需要4000倍稀釋。推薦兩步稀釋。第一步，10 μl樣本+ 490 μl 1×檢測緩沖液。第二步，10 μl第一步稀釋的混合樣本+ 790 μl 1×檢測緩沖液。

3. 試劑準(zhǔn)備

檢測前請將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫。

如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37℃溫浴，直至結(jié)晶全部溶解。

1×洗液

吸取20×濃縮洗液50 ml至1 L的量筒，加蒸餾水至1,000 ml，輕輕混勻，避免泡沫。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。2-25℃貯存，1×洗液可穩(wěn)定保存30天。

1×檢測緩沖液

吸取10×濃縮檢測緩沖液15ml至250 ml量筒，加蒸餾水至150 ml，輕輕混勻，避免泡沫。2-8℃貯存，1×檢測緩沖液可穩(wěn)定保存30天。

檢測抗體

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用1×檢測緩沖液按1：100稀釋濃縮的檢測抗體。

注意：請在30分鐘內(nèi)使用稀釋后的檢測抗體。

辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用1×檢測緩沖液按1：100稀釋濃縮的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。

注意：請在30分鐘內(nèi)使用稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。

樣本稀釋

如果樣本需要稀釋，請用試劑盒提供的1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞培養(yǎng)上清。

IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品

開蓋前短暫離心，用蒸餾水重溶IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品，重溶體積標(biāo)注于IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)簽上。輕柔地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶后標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為2,000 pg/ml。重溶后靜置10 -30分鐘。稀釋前充分混勻。

請使用聚丙烯管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。

血清/血漿樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

取230 μl濃縮的IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品，加入230 μl1×檢測緩沖液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度(1,000 pg/ml)。在每一個試管中加入230 μl1×檢測緩沖液。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做1：1系列稀釋。每次移液時，請確保充分混勻。以1×檢測緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

取230 μl濃縮的IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品，加入230 μl細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度(1,000 pg/ml)。在每一個試管中加入230 μl細(xì)胞培養(yǎng)基。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做1：1系列稀釋。每次移液時，確保充分混勻。以細(xì)胞培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。

4.檢測步驟

檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫。

1) 準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

2) 將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封好封口。

3) 浸泡酶標(biāo)板：加入300 μl1×洗液靜置浸泡30秒。為了獲得理想的實驗結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后，在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。

4) 加標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100 μl2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻卓准尤?/span>100 μl 1×檢測緩沖液(血清/血漿樣本)或培養(yǎng)基(細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本)。

5) 加加樣本：血清/血漿：樣本孔加入100 μl預(yù)稀釋樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清：樣本孔加入100 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清。(樣本稀釋請參考第6頁“樣本準(zhǔn)備”)。保證步驟4、5連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在15分鐘內(nèi)完成。

6) 孵育：使用封板膜封板。300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育2小時。

7) 洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μl洗液洗板，洗滌6次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必須徹底移除殘留液體。

8) 加檢測抗體：每孔加入100 μl稀釋的檢測抗體(1:100稀釋)。使用封板膜封板。300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育1小時。

9) 洗滌：重復(fù)步驟7。

10) 加酶孵育：每孔加入100 μl稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(1:100稀釋)。使用新的封板膜封板。300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育45分鐘。

11) 洗滌：重復(fù)步驟7。

12) 加底物顯色：每孔加入100 μl顯色底物TMB，避光，室溫孵育5 -30分鐘。

13) 加終止液：每孔加入100 μl終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。

14) 檢測讀數(shù)：在30分鐘之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和570 nm或630 nm參考波長下的OD值。校準(zhǔn)后的OD值為450 nm的測定值減去570 nm或630 nm的測定值。僅使用450 nm測定會導(dǎo)致OD值偏高，并且準(zhǔn)確度降低。

注意事項

1) 所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認(rèn)為具有潛在危害。

2) 推薦只有經(jīng)過良好實驗室培訓(xùn)的工作人員方可操作本試劑盒。操作時請佩戴合適的防護(hù)設(shè)施，例如白大衣、乳膠手套、安全眼鏡等。

3) 請避免試劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

4) 試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護(hù)服，及防護(hù)眼睛、手及面部的設(shè)施。

5) 本試劑盒用于科學(xué)研究，不能用于診斷治療。

6) 請不要使用其他批號或其他來源的試劑替代本試劑盒中的試劑。

7) 請不要使用過期的試劑。

8) 在試劑盒的貯存或孵育過程請避免強(qiáng)光照射。

9) 在操作試劑盒或處理樣本的區(qū)域請不要飲食。

10) 不要讓試劑或樣本接觸皮膚和粘膜。

11) 在操作試劑盒或處理樣本時請佩戴乳膠或一次性手套。

12) 顯色底物避免與氧化試劑和金屬接觸。

13) 避免氣溶膠的產(chǎn)生。

14) 為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染，請使用一次性槍頭。

15) 使用干凈的容器配制試劑。

16) 暴露于酸性環(huán)境會抑制結(jié)合。

17) 試劑的準(zhǔn)備必須使用蒸餾水或去離子水。

18) 顯色底物在使用之前必須平衡至室溫。

19) 樣本可能含有傳染性病原體，處理樣本和可能的污染材料的首選方法是121.5℃，最少1小時。

20) 液體廢棄物的處理。不含酸的液體廢棄物，加入1.0 %的次氯酸鈉，浸泡30分鐘。含酸的液體廢棄物，請先中和，再加入次氯酸鈉。

普利萊ELISA試劑盒產(chǎn)品列表：

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