普利萊 植物RNA快速提取試劑盒 貨號(hào): R1052-50

描述：Plant RNAtrip是一種單相RNA快速提取試劑盒，可高效裂解堅(jiān)固的植物細(xì)胞并強(qiáng)烈抑制RNA酶活性。細(xì)胞破碎之后，植物多糖立即被Plant RNAtrip獨(dú)特的成分結(jié)合。離心抽提步驟將RNA與滅活的RNA酶、蛋白、基因組DNA污染分離，并清除植物多糖多酚以及次生代謝產(chǎn)物。在RNA沉淀之前加入Plant RNA Aid清除植物多酚，并清除殘余的多糖。提取可在60分鐘內(nèi)完成，所提取的RNA純度極高，不含DNA和多糖和多酚污染，可用于構(gòu)建cDNA文庫、RT-PCR、Northern轉(zhuǎn)印分析、Poly(A) mRNA純化、體外翻譯、和RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。適于各種植物組織RNA提取，也特別適合富含糖原的動(dòng)物肝臟和肌肉組織提取高純度RNA。如果植物組織富含多酚和次生代謝產(chǎn)物，推薦使用Plant RNA Extraction kit (R1050)。

組成 (100次提取)：

         (1) Plant RNAtrip:  100 ml，用于植物組織裂解、分離RNA、結(jié)合植物多糖和多酚；

         (2) Plant RNA Aid:  5 ml， 用于進(jìn)一步去除植物多酚和多糖和次級(jí)代謝產(chǎn)物。

適用范圍：

適用于各種植物組織。每1 ml Plant RNAtrip試劑可裂解200 mg新鮮或凍存植物組織或5-10 ′ 10⁶個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞。也特別適用于富含糖原的動(dòng)物肝臟肌肉組織。

儲(chǔ)存條件: 4°C密封避光保存

 效期：1年

用戶實(shí)驗(yàn)用品和操作準(zhǔn)備：

極微量的RNA酶都會(huì)導(dǎo)致RNA降解。分離RNA時(shí)RNA酶污染主要來自以下五個(gè)方面：(1) 實(shí)驗(yàn)人員的雙手。(2) 器皿、吸頭離心管、自備液體。(3) 組織細(xì)胞破碎不可避免地釋放內(nèi)源RNA酶。(4) RNA未能完全與蛋白質(zhì)分離。(5) RNA沉淀和溶解時(shí)來自吸頭離心管和溶液。我們的Step by Step質(zhì)量監(jiān)測(cè)表明，Plant RNAtrip可強(qiáng)烈抑制RNA酶活性并在分離步驟清除RNA酶。因此在有Plant RNAtrip存在的步驟，使用高壓消毒20分鐘的吸頭離心管和溶液即可勝任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后，來自實(shí)驗(yàn)材料的RNA酶污染將會(huì)導(dǎo)致RNA降解，因此應(yīng)嚴(yán)格使用高壓滅活RNA酶的用品。戴手套無疑是有益的。只要嚴(yán)格按照本指南進(jìn)行準(zhǔn)備和操作，使用Plant RNAtrip總是能獲得高純度RNA。

1. 固體組織破碎設(shè)備?？捎孟铝醒b置之一：1)玻璃勻漿器。泡酸清潔，用高壓滅菌蒸餾水洗滌數(shù)次。2)研缽。適用于液氮凍存組織的研磨，清洗方法同玻璃勻漿器。3)高速機(jī)械勻漿器(Polytron，Tekmar或類似產(chǎn)品)，打開開關(guān)，在蒸餾水中清洗分散器頭數(shù)次。

2. 高壓蒸汽30分鐘消毒一次性吸頭離心管。RNA沉淀溶解之后，應(yīng)嚴(yán)格使用高壓消毒的一次性用品。然而Plant RNAtrip能在RNA酶污染環(huán)境下工作，在裂解步驟可使用未高壓但潔凈的一次性吸頭和離心管，但僅推薦在緊急情況下這樣做。

3. 普通雙蒸水，高壓消毒20分鐘。用于沖洗器皿，配制瓊脂糖凝膠和電泳用緩沖液。DEPC處理的雙蒸水。加DEPC到水中至終濃度為0.01% v/v，室溫過夜，高壓消毒30分鐘。用于溶解RNA，配制TE緩沖液和75％乙醇。

4. 濕冰。在冰上進(jìn)行操作有助于減少RNA降解。

5. 其它用品。電泳槽，雙蒸水沖洗。離心機(jī)和加樣器，無需處理。

6. 戴手套。注意某些實(shí)驗(yàn)如提取質(zhì)粒DNA如使用極大量RNA酶，為防污染，須全面仔細(xì)清洗實(shí)驗(yàn)器具和實(shí)驗(yàn)區(qū)域。

RNA提取程序：

1. 植物組織細(xì)胞破碎與裂解

       冰上操作。立即并快速破碎組織至關(guān)重要。初始組織細(xì)胞過量不僅使RNA得率下降，還將導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)污染。

      1.1.植物組織破碎與裂解

       確定組織用量：推薦按比例每50-200 mg新鮮植物組織加1 ml Plant RNAtrip，但植物組織用量的上限變化甚大。(1)某些新鮮植物組織含水量甚高，而較干燥的植物組織50mg可能已經(jīng)接近上限。為獲足量RNA必須測(cè)試加入每種組織的量。注意使用過量的組織將導(dǎo)致提取失敗。 (2) 軟組織、葉片、花、多汁組織、發(fā)芽種子等可直接加入Plant RNA Reagent研磨破碎，而堅(jiān)硬的植物組織如種子、木質(zhì)莖干等最好先在液氮中研磨破碎為粉末。

      按比例每50-200 mg植物組織加1 ml Plant RNAtrip，按下列方法之一裂解組織。(1) 研缽：適用于液氮凍存組織。將液氮凍存組織研成粉末，加1 ml Plant RNAtrip，繼續(xù)研磨組織至完全破碎也可轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器繼續(xù)研磨。(2) 玻璃勻漿器：放入剪碎的新鮮植物組織，加入1 ml Plant RNAtrip，放置冰上，上下手動(dòng)勻漿組織10-20次。(3) 內(nèi)切式高速機(jī)械勻漿器：將植物組織放入塑料或玻璃試管內(nèi)，試管置冰浴燒杯中，加入1 ml Plant RNAtrip，將內(nèi)切式分散器頭插入管內(nèi)溶液中間并與組織塊接觸，轉(zhuǎn)速12,000-20,000 rpm，緩慢上下移動(dòng)試管10-20次，直到大部分組織打散。注意：少量難以打碎的組織碎片不影響后續(xù)RNA提取。用研缽和玻璃勻漿器勻漿組織時(shí)應(yīng)略微多加一些裂解液以補(bǔ)充裂解產(chǎn)物粘在器皿壁上造成的體積丟失。破碎組織用玻璃勻漿器可能比液氮研磨方便。

     1.2.植物培養(yǎng)細(xì)胞的破碎與裂解

       棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞。每5-10 ′ 10⁶個(gè)細(xì)胞加1 ml Plant RNAtrip，須有效地覆蓋瓶皿的細(xì)胞表面?；蝿?dòng)或用吸頭吹打使提取液流過并裂解所有細(xì)胞。置冰上10分鐘，傾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一處以便取出。

2 將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管，置冰上20分鐘。注意：富含多糖和多酚的植物組織可延長孵育時(shí)間至30-60分鐘。

3 12,000 ′ g 4°C 離心10分鐘。取離心后的上清液，轉(zhuǎn)移到新管。注意：組織纖維碎片、植物多糖、多酚沉淀在管底。大部分基因組DNA也在管底形成疏松粘稠的團(tuán)狀物。取上清液時(shí)如吸入少量拉絲狀DNA粘稠物，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4 加入0.2 ml氯仿，充分顛倒混勻，冰上孵育5分鐘。

5 12,000 ′ g，4°C離心10分鐘，溶液分為兩相。RNA在上層水相，下層為有機(jī)相，兩相界面為一層薄膜。吸出0.5 ml上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管。注意：取上清液時(shí)應(yīng)保留0.5-1 mm厚的水相，以免擾動(dòng)和吸入下面的碎片和有機(jī)相。如果吸入，應(yīng)將所取的上清液放回管中并重新離心10分鐘，再次吸取水相。這一點(diǎn)至關(guān)重要，違背此原則容易導(dǎo)致RNA降解和DNA污染。

6 加入上清液1/10體積(~50ml) 的Plant RNA Aid到上清液，混勻，冰上孵育15分鐘以進(jìn)一步結(jié)合植物多酚和多糖，溶液將會(huì)變渾濁。離心12,000 ′ g 4°C 10分鐘。小心吸出上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管，勿擾動(dòng)和吸入下面的透明膠凍狀多酚和多糖沉淀。注意：完全去除植物多糖至關(guān)重要，否則將明顯降低RNA回收率，并使沉淀呈難溶解的膠凍狀。

7 將步驟5或6獲得的上清約500-600ml轉(zhuǎn)移到新管，加入等體積異丙醇，混勻。冰育5-10分鐘已足以沉淀RNA。用更低的溫度和更長的時(shí)間進(jìn)行沉淀僅在組織極少時(shí)有用。

8 10,000 ′ g，4°C 離心10分鐘。管底可見少許RNA沉淀。注意：如初始組織細(xì)胞量少，RNA將附著在管壁，用肉眼幾乎難辨沉淀，但不影響實(shí)驗(yàn)。如RNA 沉淀量很多并呈膠凍狀，通常表明有多糖、多酚和蛋白污染。應(yīng)仔細(xì)檢查操作步驟。一個(gè)補(bǔ)救措施是用Plant RNAtrip溶解沉淀，從步驟2開始重新抽提沉淀。

9 棄上清。立即加入1 ml 75%乙醇，顛倒混勻數(shù)次洗滌沉淀。12,000 ′ g離心5分鐘。棄上清，盡量完全吸去管壁上的液體。注意：乙醇洗滌后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在4°C保存一周或在－20°C保存一年。

10  敞開管口空氣干燥5-10分鐘使殘留液體揮發(fā)，RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 ml自備的DEPC處理的高壓消毒純水溶解沉淀。RNA溶液可保存于－70°C或液氮中。注意：過分干燥將使RNA難以溶解。55°C加熱或反復(fù)凍融數(shù)次可以助溶。RNA溶液加3倍體積乙醇凍存于－20°C，用時(shí)離心沉淀。

說明

1.測(cè)定OD值，根據(jù)OD260計(jì)算RNA濃度。OD260/280比值可初步判斷RNA質(zhì)量，比值在1.6-2.0之間均屬正常。起始組織量過大，或吸取了有機(jī)相或碎片，將使RNA樣品中蛋白和雜質(zhì)含量高，RNA沉淀乙醇洗滌不充分(步驟8)，均可導(dǎo)致OD260/280比值降低。但切記OD260/280比值還受很多非質(zhì)量因素的影響。例如，RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，用TE或離子強(qiáng)度較高的溶液溶解時(shí)較高，但均不影響RNA后續(xù)使用。切記即便是已降解的RNA，OD260/280比值也能達(dá)到看似完美的2.0左右，因此該比值并非判斷RNA降解與否最佳的指標(biāo)。判斷RNA質(zhì)量的最佳途徑是進(jìn)行普通RNA瓊脂糖電泳檢查RNA完整性。

2. 檢查RNA完整性。取1 mg RNA樣品，加5ml 純水加1ml上樣緩沖液進(jìn)行1%普通瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色，紫外燈觀察。

3. 檢查RNA完整性。取1 mg RNA樣品，加5ml 純水加1ml上樣緩沖液，進(jìn)行1%普通瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色，紫外燈觀察。

       4. Plant RNAtrip試劑勿直接接觸皮膚和吸入。如接觸皮膚，立即用大量水清洗。

普利萊APPLYGEN常用抗體列表：

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