描述：磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞 膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞 膜 PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞 膜外側(cè)，使PS暴露在細(xì)胞 膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被公認(rèn)為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。
將Annexin V進(jìn)行紅色熒光Alexa Fluor 647標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞 膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞 膜而使細(xì)胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限是凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

組成：20次

Annexin V-Alexa Fluor 647   100uL

Propidium Iodide    200uL

Binding Buffer（4X）   4mL

儲(chǔ)存條件：2-8℃  避光

所需實(shí)驗(yàn)器材：微量移液器；PBS； 不含EDTA的胰酶消化液； 低速離心機(jī)； 流式細(xì)胞儀

操作說明：

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

a) 懸浮細(xì)胞：

1) 收集細(xì)胞至離心管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。

2) 用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

3) 再加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

b) 貼壁細(xì)胞：

1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量不含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。

2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

3）加入步驟i中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

注：加入步驟i中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V- Alexa Fluor 647導(dǎo)致染色失敗。

4）用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

5）再加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

2. 用去離子水按1：4稀釋Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去離子水）；

3. 用250ml結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×10⁶/ml；

4. 取100ml的細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，加入Annexin V- Alexa Fluor 647，輕輕混勻；

5. 室溫(20-25℃)避光孵育10min；

6. 上機(jī)前5min加入10ml 碘化丙啶溶液，輕輕混勻；

7. 上機(jī)前在反應(yīng)管中補(bǔ)加400ml PBS重懸細(xì)胞， 避光保存， 隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)， Annexin V- Alexa Fluor 647和PI均為紅色熒光。

注意事項(xiàng)：

1) 此試劑盒僅供研究使用。

2) 微量試劑需離心數(shù)秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。

3) Propidium Iodide（PI）有毒，操作時(shí)要帶手套，使用時(shí)避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

4) Annexin V-Alexa Fluor 647中含有劇毒成分疊氮化鈉（NaN₃）, 操作時(shí)要帶手套，使用時(shí)避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

5) 本試劑盒用于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1x10⁶。

6) 染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。

7) Annixin V檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法適用于懸浮生長的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測(cè)。對(duì)于貼壁生長的細(xì)胞，由于在胰酶等消化處理過程中會(huì)造成細(xì)胞 膜的損傷，會(huì)造成較高的假陽性，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，而影響檢測(cè)，可將胰酶消化后的細(xì)胞保存在含2%BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測(cè)貼壁生長的細(xì)胞。我不推薦用該方法檢測(cè)。因?yàn)槠渲貜?fù)性較差，且需要操作時(shí)非常小心。

8) 消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-Alexa Fluor 647，最終導(dǎo)致染色失敗。

9) 細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。