產(chǎn)品說(shuō)明 1 收集細(xì)胞： 對(duì)于一個(gè)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，推薦使用 10 6∽10 7 個(gè)表達(dá) mCherry 融合蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，加入 1mL 預(yù)冷的 1XPBS 于細(xì)胞培養(yǎng)皿瓶中并小心刮下細(xì)胞，之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，4℃、1200G 離心 3 分鐘，棄上清液，用預(yù)冷 1XPBS 重懸細(xì)胞，離心，棄上清，重復(fù)兩次。 2、裂解細(xì)胞 1) 對(duì)于細(xì)胞質(zhì)蛋白，用 200μL 預(yù)冷的 Lysis buffer 重懸細(xì)胞。 注：在 Lysis buffer 中加入蛋白酶抑制劑和 1mM PMSF 。 對(duì)于核蛋白可選做：在 RIPA buffer 中加入 1mg/mL DNase、2.5mM MgCl2、蛋白酶抑制劑和 1mM PMSF 2) 將離心管放在冰上 30 分鐘，每隔 10 分鐘重懸細(xì)胞一次。 3) 4℃、12000G 離心 10 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的預(yù)冷離心管中，加入 300μL dilution buffer(可用 1XPBS 代替)，棄沉淀。（ 如需要，保存 50uL 裂解 液進(jìn)行進(jìn)一步分析） 注：此步驟獲得的細(xì)胞溶解物可置于-80℃下長(zhǎng)期保存。 可選做：在稀釋液中加入 1mM PMSF 和蛋白酶抑制劑。 3 平衡 beads 1) 旋渦 Anti-mCherry-beads， 吸取 25uL （包含混懸液）放在 1.5ml 離心管中 2) 加入提前預(yù)冷的 500uL Dilution buffer（也可用 1xPBST（0.05%Tween-20）替 代） 3) 4℃，1200G 離心 3 分鐘，棄上清，重復(fù)兩次。 4 結(jié)合蛋白 1) 將第 2 步獲得的細(xì)胞蛋白提取液加入到平衡后的 Anti-mCherry-beads 中，4℃上 下顛倒孵育 1-3 小時(shí)。 2) 4℃、1200G 離心 3 分鐘，棄上清。 5 洗滌 1) 加入 500uL Dilution buffer（也可用 1xPBST（0.05%Tween-20）代替）重懸 Anti-mCherry-beads 2) 4℃、1200G 離心 3 分鐘，去掉上清，重復(fù) 2-5 次。 可選做：在第二次清洗中將鹽濃度提高至 500mM。 6 洗脫結(jié)合蛋白 1) 加入 30μL 1XSDS loading buffer 重懸 anti-mCherry-beads。 2) 將 anti-mCherry-beads 在 95°C 水浴中加熱 10 分鐘，使免疫沉淀復(fù)合物和珠子 分離。4℃,1200G 離心 3 分鐘，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析。 7 甘氨酸洗脫緩沖液洗脫（可替代步驟 6） 1) 加入 50-70ul 0.2M , pH2.5 的甘氨酸, 重懸 Anti-mCherry Agarose Beads, 保持 混勻狀態(tài)孵育 3 至 10 分鐘 , 4℃, 1200G 離心 3 分鐘 2) 將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入 25-35ul 1M pH10.4 的 Tris 中和甘氨酸，可 重復(fù)上述步驟 1 和 2以增加洗脫效率。