天門冬酰胺酶 恒添天門冬酰胺酶 廠家直銷天門冬酰胺酶

• 一、簡介

  門冬酰胺酶(asparaginase)別稱天冬酰胺酶、門冬酰胺酶等,它的主要功能是水解天門冬酰胺為天門冬氨酸與氨,在動物、微生物、植物組織中廣泛存在。動物體內(nèi)的天門冬酰胺酶主要存在于哺乳動物和鳥類的肝、胰、腎、胃和脾中。 黑曲霉中的天門冬酰胺酶有兩種狀態(tài)：一種是褐色或淺黃色的液體,一種是淡或深黃色的粉末。能溶于水,但在氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑中不溶。貯存在水溶液20℃、7天或5℃、14天酶均有活性。 黑曲霉CICC2462作為本實(shí)驗(yàn)的受體菌,該菌株具有的優(yōu)勢：高表達(dá)的蛋白能力、及強(qiáng)的分泌能力、較低的胞外蛋白酶活性、對篩選標(biāo)記潮霉素及其的敏感。通過基因置換技術(shù)把目的基因定點(diǎn)整合到內(nèi)源高表達(dá)的糖化酶基因(glaA)位點(diǎn),該位點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄的活躍區(qū),基因調(diào)控簡單,通過基因置換技術(shù)可以消除內(nèi)源高表達(dá)糖化酶基因?qū)ν庠椿虻母偁幮?yīng),可實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)、工程菌的發(fā)酵條件可以進(jìn)一步得到簡化。構(gòu)建黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-Asp,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化,該方法具有轉(zhuǎn)化效率高、同源重組率高、遺傳穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。利用hph基因表達(dá)框兩側(cè)的序列,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步刪除潮霉素篩選標(biāo)記基因,獲得食品級天門冬酰胺酶工程菌。此研究思路為國內(nèi)構(gòu)建天門冬酰胺酶工程菌提供了新的途徑,為高效安全生產(chǎn)酶制劑提供了新的表達(dá)系統(tǒng)。 主要的研究結(jié)果如下： 1.天門冬酰胺酶基因的克隆 采用CTAB法提取黑曲霉基因組,從提取的基因組中PCR克隆得到天門冬酰胺酶基因,克隆到T-載體,測序正確。 2.天門冬酰胺酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建 將測序正確T-Asp載體、pSZHG載體用相同的酶進(jìn)行酶切,然后進(jìn)行連接,構(gòu)建天門冬酰胺酶表達(dá)載體pSZHG-Asp。 3.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對黑曲霉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,通過菌落PCR進(jìn)行篩選,陽性轉(zhuǎn)化率為56.14%。然后農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子與黑曲霉共培養(yǎng),提取的基因組DNA,利用P3、P4引物進(jìn)行PCR檢測,篩選陽性轉(zhuǎn)化子,得到的陽性轉(zhuǎn)化率為30.16%。用P5、P6引物對鑒定正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證,對是否是同源重組轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定,得到同源重組轉(zhuǎn)化子率為92.45%。將其中4個菌株在含一定濃度的hphB的土豆液體或固體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)、然后進(jìn)行篩選鑒定,分別用P3、P4,P5、P6引物對20個菌落做PCR鑒定,結(jié)果表明3個菌落為純合的同源重組菌株。 4.天門冬酰胺酶在黑曲霉中的表達(dá) 用發(fā)酵培養(yǎng)基對天門冬酰胺酶進(jìn)行發(fā)酵,利用Berthelot顯色反應(yīng)測定天門冬酰胺酶的酶活,發(fā)酵時間為21天酶活達(dá)到20000U。通過SDS-PAGE電泳,在約40kD處有目的蛋白帶,由此知,天門冬酰胺酶在黑曲霉中已得到分泌表達(dá)。重組菌株的目的蛋白表達(dá)量為185μg/mL～417μg/mL。