TRIzol（總RNA提取試劑）

貨號(hào)：ZK-PL4160

品牌：子科生物ZIKER

描述：TRIzol是一種快速?gòu)慕M織細(xì)胞中提取總RNA的單相試劑。在樣品裂解過(guò)程中TRIzol能夠抑制RNA酶活性保持RNA完整性；加入氯仿后離心，RNA相將與DNA和蛋白質(zhì)分離，隨后用異丙醇沉淀RNA。如果需要還可以繼續(xù)提取DNA和蛋白質(zhì)。純化的總RNA可用于RT－PCR、Northern Blot、RNA酶保護(hù)、Poly(A) mRNA純化、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存: 4℃密封避光保存兩年有效。

適用:

(1) 固體組織 (100 mg /ml ): 人、動(dòng)物、植物的各種新鮮或凍存組織。

(2) 培養(yǎng)細(xì)胞 (5~10 x 106細(xì)胞/ml): 真核細(xì)胞，細(xì)菌，酵母。

(3) 液體標(biāo)本(100 μl/ml): 全血、體液、尿液，病毒樣品等。

操作準(zhǔn)備：

極微量的RNA酶都會(huì)導(dǎo)致RNA降解。分離RNA時(shí)RNA酶污染主要來(lái)自以下五個(gè)方面：(1) 實(shí)驗(yàn)人員的雙手。(2) 器皿、吸頭離心管、自備液體。(3) 組織細(xì)胞破碎不可避免地釋放的內(nèi)源RNA酶。(4) RNA未能完全與蛋白質(zhì)分離。(5) RNA沉淀和溶解時(shí)來(lái)自吸頭離心管和溶液。Trizol可抑制RNA酶活性, 因此在有Trizol存在的步驟中，使用高壓消毒20分鐘的吸頭離心管和溶液即可勝任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后，來(lái)自實(shí)驗(yàn)材料的RNA酶污染將會(huì)導(dǎo)致RNA降解，應(yīng)嚴(yán)格使用高壓滅活RNA酶的用品。戴手套無(wú)疑是有益的，但戴口罩和帽子則無(wú)必要。

1. 固體組織破碎設(shè)備。準(zhǔn)備下列裝置之一，

1)玻璃勻漿器。必要時(shí)泡酸清潔，用高壓滅菌蒸餾水洗滌數(shù)次。

2)研缽。適用于液氮凍存組織的研磨，清洗方法同玻璃勻漿器。

3)組織細(xì)胞超聲破碎儀器。探頭插入裝滿蒸餾水的試管或燒杯中，開(kāi)啟超聲清洗探頭30秒至1分鐘。4)高速機(jī)械勻漿器(Polytron，Tekmar或類似產(chǎn)品)。打開(kāi)開(kāi)關(guān)，在蒸餾水中清洗分散器頭數(shù)次。

2. 高壓蒸汽30分鐘消毒一次性吸頭離心管。RNA沉淀和溶解之后，應(yīng)嚴(yán)格使用高壓消毒的一次性用品。由于不可預(yù)測(cè)的原因，如：動(dòng)物已經(jīng)處死，組織已取出，細(xì)胞已收取，而吸頭和離心管尚未高壓處理。此時(shí)保險(xiǎn)做法是使用普利萊基因技術(shù)公司的另種產(chǎn)品――組織RNA保護(hù)液(Cat# R1030)，用戶可把來(lái)不及處理的標(biāo)本保存在RNA保護(hù)液中，37 oC保存3天，25 oC保存2周，4 oC保存4周，－20 oC保存數(shù)月，固體或液體標(biāo)本中RNA不會(huì)降解。

3. DEPC處理的雙蒸水。加DEPC到水中至終濃度為0.01% v/v，室溫過(guò)夜，高壓消毒30分鐘。用于溶解RNA，配制TE緩沖液和75％乙醇。

4. 普通雙蒸水。高壓消毒30分鐘，用于沖洗器皿，配制瓊脂糖凝膠和電泳用緩沖液。注意溶液配制后高壓滅菌，但瓊脂糖不能高壓處理。

5. 冰盒和濕冰。在冰上進(jìn)行操作有助于減少RNA降解。

6. 異丙醇，氯仿，純乙醇，分析純。75％乙醇用高壓消毒的蒸餾水配制。

7. 其它用品。電泳槽，雙蒸水沖洗。離心機(jī)和加樣器，無(wú)需處理。

8. 戴手套。注意某些實(shí)驗(yàn)如提取質(zhì)粒DNA使用大量RNA酶，為防污染須特別清洗實(shí)驗(yàn)器具和實(shí)驗(yàn)區(qū)域。

RNA提取程序：

1. 組織細(xì)胞破碎與裂解

冰上操作快速破碎組織至關(guān)重要。組織細(xì)胞過(guò)量不僅使RNA得率下降，還將導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)污染。

(1) 固體組織。按比例每50-100 mg組織加1 ml Trizol試劑。用研缽研磨：僅適用于液氮凍存組織。組織放在研缽中研成粉末，加1 ml Trizol試劑，繼續(xù)研磨至組織完全裂解。用玻璃勻漿器勻漿：加入Trizol上下手動(dòng)勻漿組織10-15次。用高速機(jī)械勻漿器：將組織放入塑料試管內(nèi)，試管置冰浴燒杯中，加入Trizol試劑，將分散器頭垂直插入管內(nèi)與組織塊接觸，轉(zhuǎn)速12,000-20,000 rpm，上下移動(dòng)試管10-20次，直到組織完全打散，無(wú)肉眼可見(jiàn)大塊。用超聲儀：根據(jù)機(jī)器型號(hào)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，選取能有效破碎組織的功率和時(shí)間。

注意：

(1)由于Trizol卓越的性能，通常用50-100 mg組織可獲得足量的RNA，對(duì)絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康木b綽有余。加入過(guò)量組織或過(guò)少Trizol容易導(dǎo)致提取失敗。

(2)少量難以打碎的組織碎片不影響后續(xù)RNA提取。

(3)用研缽和玻璃勻漿器勻漿破碎組織時(shí)，應(yīng)略微多加一些裂解液，以補(bǔ)充裂解產(chǎn)物粘在容器壁上造成的體積丟失。

(2) 培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞：棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞一次。每5-10′106個(gè)細(xì)胞加1 ml Trizol試劑，但Trizol加入量必須有效地覆蓋瓶皿的細(xì)胞表面。一個(gè)75 cm2瓶皿的細(xì)胞通常需要2 ml提取液，一個(gè)35 cm2瓶皿的細(xì)胞需要 1 ml提取液，更小的培養(yǎng)瓶皿可使用更少的提取液，但后續(xù)操作會(huì)因體積過(guò)小而極為不便?；蝿?dòng)或用吸頭吹打使提取液流過(guò)并裂解所有細(xì)胞。置冰上5分鐘，傾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一處以便取出。懸浮細(xì)胞：低速離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞快速重懸于50-100ml的PBS或去離子水中，每5-10′106細(xì)胞加1 ml Trizol裂解。注意直接裂解未重懸的細(xì)胞沉淀，裂解物將十分粘稠而難以分散。細(xì)菌酵母：離心收集沉淀，加入50-100ml去離子水重懸細(xì)胞。每107細(xì)胞加入1-2 ml Trizol直接裂解。某些細(xì)菌和酵母細(xì)胞可能需要?jiǎng)驖{破碎。

(3) 液體標(biāo)本：如體液、尿液、全血。每100ml液體樣品加1 ml Trizol，置冰上1-3分鐘。未抗凝的凝固血液按固體組織處理。Trizol Liq (Cat# R1020)產(chǎn)品專門(mén)用于液體標(biāo)本RNA提取。

2. 將組織細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管，置冰上10分鐘。

優(yōu)化步驟：如果組織裂解物含較多的碎片，或提取植物組織，12,000g 4 oC 離心10 分鐘，取上層裂解液，棄管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪組織，12,000g 4 oC 離心10 分鐘，小心吸掉最上面的油層，棄去。再取裂解液，棄管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如帶少量油滴不影響提取。

3. 加入0.2體積的氯仿(0.2ml)，充分顛倒混勻，冰上孵育1-5 分鐘，溶液開(kāi)始分相。有時(shí)分相不明顯，不影響提取。

4. 離心12,000 ′ g 4 oC 10分鐘，溶液分為兩相。RNA在上層水相，下層為有機(jī)相，兩相界面是一層薄膜其厚度與組織細(xì)胞類型和多少有關(guān)。小心吸出0.5ml上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管。

注意：取上清液時(shí)應(yīng)保留0.5-1 mm厚的水相，以免擾動(dòng)和吸入下面的碎片和有機(jī)相。如果吸入，應(yīng)將所取的上清液放回管中并重新離心10分鐘，再次吸取水相。這一點(diǎn)至關(guān)重要，違背此原則容易導(dǎo)致RNA降解和DNA污染。如需同時(shí)提取DNA或蛋白質(zhì)，則保留中間相和下層有機(jī)相，向公司索要操作方法。

5. 加入等體積異丙醇(0.5ml)于上清液充分混勻。冰上孵育10 分鐘沉淀RNA。用更低的溫度和更長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行沉淀并不必要。如果起始組織細(xì)胞的量很少，－20 oC放置一至數(shù)小時(shí)可沉淀幾乎所有的RNA。

注意：從富含多糖的植物組織或富含糖原的動(dòng)物肝臟組織提取RNA時(shí)，按以下步驟進(jìn)行：以每1 ml Trizol裂解組織，加氯仿后離心得到約0.5 ml上清液計(jì)算，分別加入上清液一半體積即0.25 ml 的高鹽溶液(0.8 M 檸檬酸鈉和1.2 M NaCl)和0.25 ml異丙醇，混勻。執(zhí)行下面的離心沉淀步驟6。離心后可有效沉淀RNA，但多糖或糖原存留在上清可被棄去。從富含多糖的植物和動(dòng)物肝臟組織提取RNA時(shí)，推薦使用植物RNA分離試劑Plant Trizol或Plant RNA Extraction Kit。

6. 12,000g，4 oC 離心10分鐘。管底可見(jiàn)少許RNA沉淀。

注意：如初始組織細(xì)胞量少，RNA將附著在管壁，用肉眼幾乎難辨沉淀，但不影響實(shí)驗(yàn)。如RNA沉淀量很多并呈膠凍狀，通常表明有蛋白污染。應(yīng)仔細(xì)檢查操作步驟。

7. 棄上清。立即加入1ml 75%乙醇，顛倒混勻數(shù)次洗滌沉淀。12,000g離心5分鐘。棄上清，盡量完全吸去管壁上的液體。

注意：乙醇洗滌后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在4 oC

保存一周或在－20 oC保存一年。

8. 敞開(kāi)管口，空氣干燥5-10分鐘使殘留液體揮發(fā)，RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 ml自備的DEPC處理的高壓消毒純水或TE溶解沉淀。RNA溶液可保存于－70 oC或液氮中。

注意：過(guò)分干燥將使RNA難以溶解。55 oC加熱或反復(fù)凍融數(shù)次可以助溶。RNA溶液加3倍體積乙醇凍存于－20 oC，用時(shí)離心沉淀。

說(shuō)明：

1. 每100mg組織RNA預(yù)期得率為：肝脾60－100mg, 腎50mg, 腦組織10-15mg, 胎盤(pán)20－40mg, 脂肪50mg。1 x 107個(gè)細(xì)胞通常得50－100mg。

2. 測(cè)定OD值，根據(jù)OD260計(jì)算RNA濃度。OD260/280比值可初步判斷RNA質(zhì)量，比值在1.6-2.0之間均屬正常。起始組織量過(guò)大，或吸取了有機(jī)相或碎片，將使RNA樣品中蛋白和雜質(zhì)含量高，RNA沉淀乙醇洗滌不充分(步驟8)，均可導(dǎo)致OD260/280比值降低。例如，RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，用TE或離子強(qiáng)度較高的溶液溶解時(shí)較高，但均不影響RNA后續(xù)使用。切記即便是已降解的RNA，OD260/280比值也能達(dá)到看似完美的2.0左右，因此該比值并非判斷RNA降解與否最佳的指標(biāo)。判斷RNA質(zhì)量的最佳途徑是進(jìn)行普通RNA瓊脂糖電泳檢查RNA完整性。

3. 檢查RNA完整性。取1 mg RNA樣品進(jìn)行1%普通瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色，紫外燈觀察。28S RNA~5 kb亮度應(yīng)該約為18S RNA~2 kb的兩倍，有時(shí)可見(jiàn)0.1-0.3 kb 的5S RNA。

4. 調(diào)整RNA溶液的體積或重沉淀RNA。(1) 加入適量DEPC處理過(guò)的高壓消毒純水或TE緩沖液，于RNA溶液中，使溶液體積補(bǔ)齊到約400 ml；(2) 加入 0.1 體積的3M 醋酸鈉 pH 5.2，混勻；(3) 加入2.5體積的純乙醇，混勻；(4) 冰上孵育10 分鐘；(5) 12,000g 4 oC 離心10 分鐘，棄上清；(6) 執(zhí)行上述RNA提取程序的步驟6－8。

5. Trizol勿直接接觸皮膚和吸入。如接觸皮膚，立即用大量水清洗。