Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8），是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測(cè)的試劑盒。 

CCK-8試劑中含有WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）是一種類似于MTT的化合物，它在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在條件下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物Formazan （參考圖1），生成的Formazan數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析，細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。

保存條件：4℃避光保存，一年有效。-20℃可以儲(chǔ)藏兩年，但反復(fù)凍融會(huì)增加背景值，干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)定，因此請(qǐng)將經(jīng)常使用的試劑保存在4 ℃。 

操作事項(xiàng)：請(qǐng)參閱說明書

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì) 

靈敏度高，線性范圍寬，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好

操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力

水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細(xì)胞

無需放射性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低

為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用

適合于高通量藥物篩選

檢測(cè)效果與國(guó)外品牌相媲美

注意事項(xiàng)

建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

 CCK-8 反應(yīng)時(shí)間的確定：一般情況下，白細(xì)胞顯色比較困難，因此需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng) CCK-8 反應(yīng)時(shí)間。懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難顯色，因此懸浮細(xì)胞在加入 CCK-8 培養(yǎng)0.5-4小時(shí)后，可先從培養(yǎng)箱取出，目測(cè)或用酶標(biāo)儀測(cè)定顯色程度，若顯色困難可以繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后再確定。對(duì)于貼壁細(xì)胞，CCK-8 的培養(yǎng)時(shí)間一般為 0.5-4 小時(shí)，在培養(yǎng) 20 分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度。

每孔接種細(xì)胞數(shù)：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1000個(gè)/孔 (100 μl培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2500個(gè)/孔 (100 μl培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

設(shè)定空白對(duì)照：在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)）時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。

影響CCK-8測(cè)定的物質(zhì)：由于CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性的原理是通過檢測(cè)活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)，所以如果待測(cè)體系中存在氧化還原物質(zhì)則可能會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，還原性物質(zhì)會(huì)使吸光度增加，氧化性物質(zhì)會(huì)使吸光度減小，因此應(yīng)需設(shè)法去除這些物質(zhì)的影響。酚紅和血清對(duì)本試劑盒的測(cè)定無明顯影響，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除只含有培養(yǎng)基的對(duì)照孔中本底吸光度而消除，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

測(cè)定波長(zhǎng)：如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液，建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但是450nm檢測(cè)靈敏度*。

當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用。

如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細(xì)胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8檢測(cè)。

為了您的安全和健康，操作時(shí)請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套。