升級版線粒體提取試劑盒（組織和細(xì)胞通用）

貨號：ZK-PL3524

品牌:子科生物ZIKER

描述：

線粒體制備試劑盒 (Mitochondria Isolation Kit)用于從組織或培養(yǎng)細(xì)胞中分離線粒體和細(xì)胞胞漿成分。加入分離溶液，勻漿破碎組織細(xì)胞，經(jīng)過數(shù)次800g和12000g離心，在60分鐘內(nèi)即可分離出完整的線粒體和胞漿成分。制備的線粒體具有很高的生物學(xué)活性，可進(jìn)行各種功能研究如酶學(xué)測定，更可用于Western Blot、2D-膠、線粒體蛋白或DNA提取、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究。

嚴(yán)格按照說明操作，總是能制備獲得高純度線粒體。一篇方法學(xué)研究論文發(fā)現(xiàn)，用普利萊試劑盒制備線粒體的得率、活性、純度優(yōu)于蔗糖密度梯度離心法和Invotrogen/Pierce線粒體提取試劑盒方法。

適用：

從組織、培養(yǎng)細(xì)胞制備高純度線粒體，同時分離細(xì)胞胞漿成分。

組成：

Mito Solution  100ml for 50次制備；200ml for 100次制備

儲存：

?20oC 12個月有效

操作步驟：

以下所有操作均在4oC進(jìn)行

1.組織勻漿：100~200mg新鮮組織如肝、腦、腎、心肌等，剪為0.5cm2 碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。估計組織塊總體積。加入1.5ml冰預(yù)冷的Mito

Solution。用間隙嚴(yán)緊的研杵上下研磨組織20次。

培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：800×g 5min離心收集細(xì)胞。單次提取需2-5×107個細(xì)胞。加入1.5ml冰預(yù)冷Mito Solution重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃

勻漿器內(nèi)，用間隙嚴(yán)密的研杵研磨細(xì)胞30次。

2.將勻漿液轉(zhuǎn)移到離心管中，800×g，4oC離心5min。（胞核、膜碎片、未裂解細(xì)胞等在管底，棄去）

3.收集上清液并轉(zhuǎn)移到新的離心管。再次800×g離心5min at 4oC，棄沉淀。

4.將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管。10,000×g離心10min 4 oC。線粒體沉淀在管底。離心后的上清含胞漿成分，可收集用于對照實(shí)驗(yàn)。

5.洗滌線粒體：加入0.2ml Mito Solution，輕彈管底重懸線粒體沉淀；12,000×g離心10min 4oC。棄上清，線粒體沉淀在管底。

6.重懸線粒體：可以用Mito Solution重懸線粒體沉淀，也可以用合適后續(xù)實(shí)驗(yàn)的自備緩沖液來裂解線粒體沉淀，具體用量是：約每100mg組織提取的

線粒體用50μl，約每5×107個細(xì)胞提取的線粒體用100μl。用量請根據(jù)組織或細(xì)胞類型進(jìn)行微調(diào)。

7.裂解線粒體后，進(jìn)行蛋白濃度測定。立即使用或?70oC保存。

說明：

1.制備高質(zhì)量線粒體的關(guān)鍵：第一，全程低溫操作，將樣品管放在冰水浴而不是碎冰塊中；第二，快速，微量制備比大規(guī)模制備操作更快速，更容易

獲得完整的線粒體，且得率高；第三，在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞是制備線粒體的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。破碎效果與組織細(xì)胞類型有關(guān)；與組織塊相

比，貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時較難破壁。用1-3ml小容量玻璃勻漿器(而不是其它破碎裝置)上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞20-30次。玻璃勻漿器

須配套選用間隙嚴(yán)密的研杵，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，可提起研杵而套管不會脫落。正確的勻漿不是旋轉(zhuǎn)研杵，而是上下緩慢推拉研

杵，研杵推進(jìn)和提升過程中細(xì)胞遭受壓力的劇變而破碎。研磨程度可用相差顯微鏡進(jìn)行檢查當(dāng)未裂解細(xì)胞在~50%即可。過度研磨會破壞線粒體，而研

磨不足將降低線粒體得率。

2.如果不得不用電動勻漿器(polytron)，可選用6500轉(zhuǎn)，刀頭上下進(jìn)出4次共計10秒。不同的電動勻漿器性能差別甚大，除非步步監(jiān)測，否則分離結(jié)果

難以預(yù)料。

3.不同的離心機(jī)必須跟據(jù)離心力g計算正確的離心轉(zhuǎn)速(允許10%波動)，否則將導(dǎo)致不純。

4.進(jìn)行Western Blot可直接用RIPA裂解液或SDS-PAGE樣品緩沖液裂解線粒體；也可先用Mito Solution重懸線粒體，再加入2x SDS-PAGE樣品緩沖液。

5.Cytochrome oxidase, Monoamine oxidase, Succinate dehydrogenas, Glutamate dehydrogenase可用作線粒體的標(biāo)志酶。

6.重懸線粒體：可以用Mito Solution重懸線粒體沉淀，也可以用合適后續(xù)實(shí)驗(yàn)的自備緩沖液來裂解線粒體沉淀具體用量是：約每100mg組織提取的線

粒體用50μl，約每5×10^7個細(xì)胞提取的線粒體用100μl。用量請根據(jù)組織或細(xì)胞類型進(jìn)行微調(diào)。

7.裂解線粒體后，進(jìn)行蛋白濃度測定。立即使用或?70oC保存。