固定相構(gòu)造差異

裝填有多孔介質(zhì)的色譜柱，固定相由多孔顆粒（porous particle）組成。如果把一個(gè)多孔顆粒看作是球形，那么球體表面會(huì)有許多孔，孔內(nèi)部有眾多溶質(zhì)分子的結(jié)合位點(diǎn)。顆粒的直徑稱(chēng)為粒徑，孔的直徑稱(chēng)為孔徑。顆粒之間的空間稱(chēng)為空隙體積。Buffer溶液是無(wú)法流穿多孔顆粒介質(zhì)內(nèi)部的，他們永遠(yuǎn)選擇顆粒間隙阻力最小的流路。

整體柱（monolith）由一整塊高度連通的管道組成，流體在均勻分布的管道里流動(dòng)。整體柱基質(zhì)由聚甲基丙烯酸酯組成，管道的平均大小是2um。在整體柱內(nèi)部，每個(gè)管道與其他16個(gè)，甚至更多的管道連通。管道的高連通性有助于流體的均勻分布，減少運(yùn)行壓力，實(shí)現(xiàn)高流速，低柱壓。整體柱整個(gè)管道的表面都可以用于結(jié)合溶質(zhì)分子，從而造成固定相擁有很高的結(jié)合容量。

=多孔顆粒填充柱和整體柱

傳質(zhì)方式差異

固定相介質(zhì)構(gòu)造差異造成色譜內(nèi)流體模式和溶質(zhì)傳質(zhì)方式的差異，進(jìn)而引起溶質(zhì)分子結(jié)合效率和洗脫效率的差異。對(duì)于色譜的固定相來(lái)說(shuō)，其動(dòng)態(tài)結(jié)合容量（dynamic capacity）取決于生物分子的大小，可接觸到的表面積以及生物分子實(shí)現(xiàn)傳質(zhì)的方式。

擴(kuò)散和對(duì)流基本概念

生物分子從流動(dòng)相移動(dòng)到固定相的過(guò)程，稱(chēng)為傳質(zhì)（mass transport）。在流體中，實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)傳質(zhì)的方式有2種，一種是擴(kuò)散（diffusion），一種是對(duì)流（convection）。

擴(kuò)散的驅(qū)動(dòng)力是分子朝著隨機(jī)方向的熱運(yùn)動(dòng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)為順濃度梯度。當(dāng)物質(zhì)在空間中的分布存在濃度差時(shí)，濃度差就會(huì)引起擴(kuò)散，最終隨著時(shí)間的推移，物質(zhì)在空間上的分布更加均勻。

對(duì)流是由外力驅(qū)動(dòng)的流體整體運(yùn)動(dòng)引起的質(zhì)量傳遞，例如，液體水的流動(dòng)會(huì)輸送水中溶解的分子或者離子。在色譜中，這種外力是由泵或者重力產(chǎn)生的壓力差，壓力差會(huì)引起介質(zhì)整體的流動(dòng)。

這些概念代表是色譜吸收基質(zhì)的理想狀態(tài)，實(shí)際情況下，固定相配體和溶質(zhì)之間的吸引作用或者排斥作用起 的主導(dǎo)作用。但是，了解溶質(zhì)傳質(zhì)的方式對(duì)于理解不同介質(zhì)的性能是非常有必要的。

多孔介質(zhì)中的擴(kuò)散傳質(zhì)

一個(gè)5000bp 的質(zhì)粒DNA，其質(zhì)量是3MDa，而巨無(wú)霸蛋白IgM的質(zhì)量才只有960KD。在色譜環(huán)境中，核酸分子要表現(xiàn)得比相同質(zhì)量的蛋白分子大很多。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上講，生物分子在空間隨機(jī)翻轉(zhuǎn)，表現(xiàn)得更像是一個(gè)球體，其直徑等于最長(zhǎng)構(gòu)象。生物分子在流體中的直徑，并不直接和質(zhì)量相關(guān)，而是取決于水合直徑（hydrodynamic diameter）。相同質(zhì)量的分子，線性構(gòu)象的分子要表現(xiàn)得比球狀構(gòu)象的分子更大，例如線性質(zhì)粒DNA，線性構(gòu)象的RNA分子。也就是說(shuō)，不管是單純從質(zhì)量上來(lái)說(shuō)，還是從水合直徑上來(lái)看，核酸都屬于超級(jí)大分子。

生物分子的大小是非常重要的，因?yàn)樗鼪Q定著擴(kuò)散速率。擴(kuò)散是分子從高濃度區(qū)域向濃度低區(qū)域的隨機(jī)熱運(yùn)動(dòng)，非常緩慢，而且隨著分子變大，擴(kuò)散會(huì)變得更慢。舉例說(shuō)明，1.2kb RNA分子，其質(zhì)量是400KD，分子大小是107nm，而IgG蛋白分子量是155KD，其分子大小是11.5nm。1.2kb RNA分子擴(kuò)散系數(shù)要比IgG蛋白慢10倍多，打個(gè)比方，IgG從大拇指指甲蓋的中心擴(kuò)散到最邊緣需要超過(guò)1年的時(shí)間，那么107nm RNA分子需要超過(guò)10年的時(shí)間。

在色譜中，固定相和流動(dòng)相之間的距離非常小，納米級(jí)到微米級(jí)，但是對(duì)于依靠擴(kuò)散的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)生物分子傳質(zhì)過(guò)程的多孔介質(zhì)來(lái)說(shuō)，這樣的距離是非常大的。在裝填多孔顆粒的色譜柱中，擴(kuò)散是溶質(zhì)分子進(jìn)出顆?？讖絻?nèi)部的 方式（因?yàn)榭讖絻?nèi)部的流速為0），溶質(zhì)分子越大，擴(kuò)散就越慢，那么固定相多孔介質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量就越低。

此外，在多孔顆粒色譜中，對(duì)流傳質(zhì)和擴(kuò)散傳質(zhì)的相互作用也會(huì)造成固定相介質(zhì)結(jié)合容量的降低。在對(duì)流將生物大分子沖走之前，它有一個(gè)非常短的時(shí)間擴(kuò)散進(jìn)入多孔顆粒內(nèi)部。流速越快，窗口時(shí)間就會(huì)越短，溶質(zhì)來(lái)不及擴(kuò)散進(jìn)入顆?？讖絻?nèi)部，就已經(jīng)通過(guò)對(duì)流沖走了，因此顆粒的結(jié)合容量就會(huì)越低。由于生物大分子擴(kuò)散系數(shù)降低引起的色譜固相介質(zhì)結(jié)合容量的降低，可通過(guò)降低流速來(lái)彌補(bǔ)?？偨Y(jié)來(lái)說(shuō)，在多孔顆粒介質(zhì)中，固定相結(jié)合容量跟流速和溶質(zhì)大小成反比。

整體柱中的對(duì)流傳質(zhì)

固相介質(zhì)孔徑和結(jié)合表面積差異

大分子物質(zhì)，比如核酸，在整體柱中擁有更高的結(jié)合容量，這也同整體柱為生物大分子提供了一個(gè)更大的結(jié)合表面積有關(guān)。對(duì)于整體柱來(lái)說(shuō)，內(nèi)部管道的整個(gè)表面積都是可以被溶質(zhì)分子結(jié)合的。

在多孔介質(zhì)色譜柱中，溶質(zhì)分子可以毫無(wú)障礙地接觸到顆粒外部全部的表面積，但是外部表面積只占到顆粒孔徑內(nèi)部表面積的2%。只有更大的顆粒孔徑才能容納更大的溶質(zhì)分子，但是，溶質(zhì)分子要毫無(wú)限制地結(jié)合到顆?？讖絻?nèi)部表面，需要顆粒的平均孔徑超過(guò)溶質(zhì)分子十倍之多。多孔介質(zhì)的孔徑超過(guò)100nm是非常罕見(jiàn)的，因?yàn)榭讖竭^(guò)大會(huì)降低顆粒穩(wěn)定性。

1998年，有人用共聚焦顯微鏡觀察到質(zhì)粒DNA主要吸附在顆粒的外表面,無(wú)法進(jìn)入顆粒內(nèi)部 。多孔介質(zhì)對(duì)于蛋白來(lái)說(shuō)，具有更高的結(jié)合能力，因?yàn)榈鞍卓梢赃M(jìn)入顆?？讖絻?nèi)部，占據(jù)孔徑內(nèi)表面。在蛋白和核酸混合物中，這意味著蛋白會(huì)優(yōu)先占據(jù)顆?？讖絻?nèi)部空間。盡管這樣會(huì)把顆粒外部大量的表面積留給核酸大分子，但不幸的是，顆粒外表面積只占據(jù)整個(gè)可結(jié)合表面積極其小的一部分，對(duì)于介質(zhì)結(jié)合容量的改善微乎其微。

在整體柱中，不管大小，所有的溶質(zhì)分子均有同等的機(jī)會(huì)結(jié)合到開(kāi)放管道內(nèi)表面上。這樣會(huì)造成占據(jù)單位表面積的小分子溶質(zhì)結(jié)合質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于占據(jù)相同表面積的大分子溶質(zhì)結(jié)合質(zhì)量。因此對(duì)于整體柱來(lái)說(shuō)，大分子溶質(zhì)會(huì)產(chǎn)生更高的結(jié)合容量。相反，多孔介質(zhì)無(wú)法從這樣的關(guān)系中獲益，因?yàn)榇蠓肿拥拖碌臄U(kuò)散系數(shù)會(huì)限制其實(shí)現(xiàn)單位表面積的飽和占據(jù)。

因此，從顆?？讖胶徒橘|(zhì)單位面積的結(jié)合質(zhì)量來(lái)看，整體柱更適合大分子溶質(zhì)，因?yàn)槠淇梢蕴峁└叩慕橘|(zhì)結(jié)合容量。而對(duì)于小分子（蛋白）來(lái)說(shuō)，多孔介質(zhì)具有更高效的結(jié)合能力。

固相介質(zhì)彌散差異

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)彌散（dispersion）是由于流體速度差異造成的。當(dāng)流體流過(guò)管道時(shí)，由于摩擦力的存在