實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

參數(shù)規(guī)格：

產(chǎn)品名稱：短古柏線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

英文名稱：Cooperia curticei

貨號: GOY-M3867

產(chǎn)品規(guī)格：50T

產(chǎn)品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸

產(chǎn)品保存：-20℃保存

產(chǎn)品有效期：一年

產(chǎn)品及特點(diǎn):

是從土壤農(nóng)桿菌 CP4 菌株中分離得到的抗除草劑草甘膦基因，是轉(zhuǎn)基因植物研究中最為常用的一種篩選標(biāo)記基因，因此本公司根據(jù)探針法 qPCR 原理開發(fā)了專門用于檢測 鮑皰疹樣病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 根據(jù) 鮑皰疹樣病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 保守區(qū)域設(shè)計引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的

鮑皰疹樣病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 成分，但不能檢測其他非 鮑皰疹樣病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 成分。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。

6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR。

操作步驟：

下列圖示以Venor Gem OneStep 支原體 常規(guī)PCR 檢測試劑盒 (一步法)，具體產(chǎn)品操作以說明書為準(zhǔn)。

第1步：樣本處理：

第2步：試劑制備：

第3步：PCR體系建立：

第4步：啟動PCR反應(yīng)

第5步：電泳結(jié)果分析

191bp為內(nèi)控對照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。

當(dāng)樣本存在支原體污染時，由于內(nèi)控對照與支原體DNA存在競爭，內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ɡ缰гwDNA＞103拷貝）。

陽性對照中支原體DNA＞104拷貝，內(nèi)控對照條帶會完全消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結(jié)果。

如果待測樣本對PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ê完幮詫φ障啾龋?，此時應(yīng)先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒），然后再檢測。

使用方法：

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2. 標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）

f1-Methyl-3-nitrophthalate  中文名：  分子式：C9H7NO6    性激素結(jié)合球蛋白   英文名稱：   Sex Hormone Binding Globulin   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   SHBG

1-Indanone  中文名：  分子式：C9H8O    血小板衍生生長因子   英文名稱：   Platelet Derived Growth Factor   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   PDGF

1-Indanamine hydrochloride  中文名：  分子式：C9H12ClN    胰島素原   英文名稱：   Proinsulin   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   PINS

1-Hydroxy-2-methylanthraquinone  中文名：1-羥基-2-甲基蒽醌  分子式：C15H10O3    催乳素   英文名稱：   Prolactin   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   PRL

1-Ethyl-3-nitrophthalate  中文名：  分子式：C10H9NO6    型脂肪酸結(jié)合蛋白   英文名稱：   Human hea Fatty Acid Binding Protein   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   hFABP

小鼠血纖蛋白原(Fbg)ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝  Minoxidil  中文名：米諾地爾  分子式：C9H15N5O 

小鼠血纖蛋白原(Fbg)ELISAKit   ELISA.   96T/48T  Minocycline hydrochloride  中文名：  分子式：C23H28ClN3O7  度：98.0%

小鼠血栓烷B2(mouse TXB2)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝     Neutral berberine sulfate  316-41-6  中文名：硫酸黃連素  分子式：C20H20NO8S 

小鼠血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝  Minisecolide C  中文名：  分子式：C28H34O7  度：%

小鼠血栓調(diào)節(jié)蛋白(mouse TM)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝  Miconazole nitrate  中文名：硝酸咪康唑  分子式：C18H15Cl4N3O4  度：98.0%

2-Benzylsuccinic acid  3972-36-9  中文名：  分子式：C11H12O4    人抑絲蛋白1(PFN1)酶聯(lián)吸附測定試劑盒   Human PFN1 (Profilin 1) ELISA Kit              

3-(tert-Butoxycarbonyl)-2,2-dimethyl-4-phenyloxazolidine-5-carboxylic acid  143527-70-2  中文名：  分子式：C17H23NO5    人中性粒細(xì)胞防御素1-3(HNP1-3)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

Atorvastatin calcium  134523-03-8  中文名：阿托伐他汀鈣  分子式：C33H35FN2O5    人嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

(2R,3S)-3-Phenylisoserine ethyl ester  143615-00-3  中文名：  分子式：C11H15NO3    人血漿抗凝蛋白S(PS)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

Desloratadine  100643-71-8  中文名：脫羧氯雷他定  分子式：C19H19ClN2    人血漿抗凝蛋白C(PC)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

短古柏線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒說明書封閉用正常山羊血清工作液  Ribavirin  36791-04-5  中文名：利巴韋林  分子式：C8H12N4O5  度：98.0%  關(guān)鍵詞： 

吩嗪甲酯   1g  Trenbolone acetate  10161-34-9  中文名：  分子式：C20H24O3  度：98.0%  關(guān)鍵詞： 

分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制物 (SLPI)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝  Anthraglycoside B  23313-21-5  中文名：大黃素-8-O-葡萄糖苷  分子式：C21H20O10 

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A   英文名稱：   Pulmonary surfacta associated protein type A   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   SP-A  4-Allyloxy-2-hydroxybenzophenone  中文名：4-丙烯氧基-2-羥基二苯甲酮  分子式：C16H14O3  度：99.0%

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 A(SP-A)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝  Atrazine  1912-24-9  中文名：阿特拉津  分子式：C8H14ClN5

服務(wù)流程：

短古柏線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒說明書1、根據(jù)客戶提供的基因序列設(shè)計特異性引物和熒光探針（染料法只需設(shè)計引物）

2、抽提DNA、RNA，并對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄

3、實時熒光定量PCR

4、提供完整的實驗結(jié)果報告(檢測數(shù)據(jù)、溶解曲線、擴(kuò)增曲線)

5、返還樣品（引物、RNA和cDNA）