武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司主營(yíng)：動(dòng)植物，細(xì)菌，細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)

間接標(biāo)記的方法中應(yīng)用了報(bào)告分子標(biāo)記的探針，報(bào)告分子通過(guò)親和酶促的方法進(jìn)行顯色。常用的報(bào)告分子如地高6辛，生物素。結(jié)合地高6辛抗6體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進(jìn)行間接的底物反應(yīng)檢測(cè)。地高6辛標(biāo)記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測(cè)時(shí)使用的地高6辛抗6體不會(huì)結(jié)合于其他的生物分子。這是相較于生物素標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。地高6辛抗6體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過(guò)氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據(jù)不同的應(yīng)用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測(cè)結(jié)果。但需注意，由于引入了免6疫檢測(cè)反應(yīng)，在放大檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，應(yīng)注意樣品內(nèi)源性酶的滅活，以降低檢測(cè)背景。

通過(guò)不同標(biāo)記方法的聯(lián)合應(yīng)用，還可在同一樣本中實(shí)現(xiàn)染色體不同區(qū)域或細(xì)胞樣本中不同RNA序列的多重檢測(cè)。

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來(lái)計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時(shí)間（t）的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot =100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒(méi)有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時(shí)間為21h，那么對(duì)于未標(biāo)記的DNA來(lái)說(shuō)，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對(duì)標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來(lái)說(shuō)Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。Tm值25℃時(shí)雜交zui佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計(jì)算雜交體Tm 值。由此式可見(jiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性。


總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗(yàn)，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放0射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。