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原位雜交技術(shù)-染色體原位雜交技術(shù)
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原位雜交(In Situ Hybridization)也叫原位雜交組化(in situ hybridization histochemistry, ISHH),是一種固相分子雜交的方法,bai它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針,在原位檢測組織或細胞內(nèi)特定核酸序列的方法。探針的種類按所帶標(biāo)記物可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類。常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P,非同位素標(biāo)記物中目前很常用的有生物素、地高6辛和熒光素三種。探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針和合成寡核苷酸探針。
原位雜交術(shù)可在原位檢測細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達,有很高的敏感性和特異性,已成為細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。
雜交液中的陽離子濃度通過靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩(wěn)定性,較高的鹽濃度將增加雜交體的穩(wěn)定性。大于0.4M的Na離子濃度,對Tm值、雙鏈復(fù)性速率的影響不大,但隨著Na離子濃度的降低,將顯著影響Tm值和雙鏈復(fù)性速率。
有2機溶2劑(甲酰胺)的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的條件下變性,那么應(yīng)用于原位雜交,樣品必須在65~75℃的條件下進行長時間變性,這將導(dǎo)致樣品形態(tài)學(xué)的破壞。50%甲酰胺的應(yīng)用能將雜交溫度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很強的水合性,高濃度的硫酸葡聚糖會使得核酸分子無法獲得周邊親水環(huán)境,增加了探針濃度,加快雜交反應(yīng)速率。
另一種多聚體促進劑是聚丙0烯0酸,用其鈉鹽,濃度為2%~4%。與硫酸葡聚糖相比,其優(yōu)點是價格低廉,粘度低(MW=90 000)。小分子化學(xué)試劑酚和Guandine thiocyanate也能促進雜交,它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進劑,只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到,該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù),該法不能用于固相雜交,因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用,即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而Guandine thiocyanate可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外,該分子還可以促進RNA的雜交,有裂解細胞而抑制RNase的作用??傊蛩崞暇厶呛途垡叶家蚰苡糜诠滔嚯s交是目前zui常用的雜交促進劑。